超聲微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Akt1基因?qū)Υ笫笮募〖毎毖?再灌注損傷保護作用的研究.pdf

1、目的: 探討超聲微泡介導(dǎo)Akt1基因轉(zhuǎn)染的可行性和安全性，觀察超聲微泡破裂法轉(zhuǎn)染PKB(Protein kinase B) /Akt1基因?qū)w外培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞摸擬缺血/再灌注 (ischemia/ reperfusion，I/R) 損傷的保護作用。
　　 方法:
　　 1. 采用胰蛋白酶、EDTA、Ι型膠原酶聯(lián)合分次消化法分離新生SD（Sprague- Dawley）大鼠心肌細胞進行體外培養(yǎng)，聯(lián)合應(yīng)用細胞差速貼壁法

2、和采用Brdu抑制法提高心肌細胞純度。用于轉(zhuǎn)染的pEGFPC1-Akt1基因，含有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因作為報告基因，熒光倒置相差顯微鏡下計數(shù)細胞轉(zhuǎn)染率。
　　 2. （1）超聲微泡介導(dǎo)Akt1基因分別轉(zhuǎn)染293FT細胞和新生大鼠心肌細胞實驗分組：293FT細胞和新生大鼠心肌細胞各分五組：A組 單純質(zhì)粒組；B組微泡+質(zhì)粒組；C組 超聲+質(zhì)粒組；D組 超聲+微泡+質(zhì)粒組；E組 超聲+微泡+質(zhì)粒（超聲探頭從培養(yǎng)皿上方浸入

3、培養(yǎng)液進行超聲輻照），每組細胞用于轉(zhuǎn)染率和壞死率檢測各設(shè)五個復(fù)孔。使超聲探頭距離培養(yǎng)皿底1cm，超聲探頭與培養(yǎng)皿底部之間填充超聲耦合劑，超聲發(fā)射頻率 1.7MHz，機械指數(shù)（mechanical index MI ）1.5，超聲輻照時間2min。使細胞培養(yǎng)液終體積為1.25ml, 微泡體積濃度為20％，培養(yǎng)液中質(zhì)粒終濃度為20ug/ml。超聲輻照6h后，每組各取5孔用于檢測轉(zhuǎn)染損傷細胞的壞死率，每組另外五孔更換為含20％胎牛血清的DME

4、M，繼續(xù)培養(yǎng)42h用作檢測細胞轉(zhuǎn)染率。
　　 （2）新生大鼠心肌細胞基因轉(zhuǎn)染的參數(shù)優(yōu)化：①.據(jù)不同機械指數(shù)實驗分三組，每組細胞用于轉(zhuǎn)染率和壞死率檢測各設(shè)五個復(fù)孔：A組 MI 0.5；B組 MI 1.0 ；C 組 MI 1.5。超聲發(fā)射頻率均為1.7MHz，超聲輻照時間均為2min，超聲輻照6h后，每組各取5孔用于檢測轉(zhuǎn)染損傷細胞的壞死率，每組另外五孔更換為含20％胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)42h用作檢測細胞轉(zhuǎn)染率。②.選用優(yōu)化

5、的超聲機械指數(shù)，據(jù)不同超聲輻照時間實驗分四組，每組細胞用于轉(zhuǎn)染率和壞死率檢測各設(shè)五個復(fù)孔：A組 超聲輻照時間1min；B組 超聲輻照時間2min；C組 超聲輻照時間3min；D組 超聲輻照時間4min。超聲發(fā)射頻率均為1.7MHz，機械指數(shù)均為1.5，使細胞培養(yǎng)液終體積為1.25ml, 微泡體積濃度為20％，培養(yǎng)液中質(zhì)粒終濃度為20ug/ml 。超聲輻照6h后，每組各取5孔用于檢測轉(zhuǎn)染損傷細胞的壞死率，每組另外五孔更換為含20％胎牛血清

6、的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)42h用作檢測細胞轉(zhuǎn)染率。③. 選用優(yōu)化的機械指數(shù)和輻照時間，據(jù)不同微泡體積濃度實驗分四組，每組細胞用于壞死率和轉(zhuǎn)染率檢測實驗各設(shè)五個復(fù)孔：A組 微泡體積濃度為10％；B組 微泡體積濃度為15％；C組 微泡體積濃度為20％； D組 微泡體積濃度為25％。超聲發(fā)射頻率均為1.7MHz，機械指數(shù)均為1.5，超聲輻照時間均為2min，使細胞培養(yǎng)液終體積為1.25ml, 培養(yǎng)液中質(zhì)粒終濃度為20ug/ml ，超聲輻照6h后，

7、每組各取5孔用于檢測轉(zhuǎn)染損傷細胞的壞死率，每組另外五孔更換為含20％胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)42h用作檢測細胞轉(zhuǎn)染率。
　　 （3）用優(yōu)化的轉(zhuǎn)染參數(shù)轉(zhuǎn)染心肌細胞，轉(zhuǎn)染Akt1基因后，檢測實驗各組細胞內(nèi)Akt1蛋白表達情況，觀察Akt1基因?qū)毎蛲霰Ｗo作用。實驗分為四組：A組 空白對照組：不轉(zhuǎn)基因，常氧培養(yǎng)48h后摸擬I/R損傷；B組 單純質(zhì)粒組，只加質(zhì)粒，常氧培養(yǎng)48h后摸擬I/R損傷；C組Akt抑制劑組，超聲微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染

8、Akt基因同時加入Akt抑制劑，轉(zhuǎn)基因后常氧培養(yǎng)48h，摸擬I/R損傷； D組 Akt組。超聲微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Akt基因后常氧培養(yǎng)48h，摸擬I/R損傷。
　　 完成摸擬I/R損傷過程后，取各組心肌細胞，免疫印跡法(Western blot法)檢測細胞內(nèi)Akt1蛋白表達情況，細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率，分析Akt1基因與細胞凋亡之間關(guān)系，探討Akt1基因抗細胞凋亡作用的機制。
　　 結(jié)果:
　　 1. 聯(lián)合酶消化法

9、培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞貼壁生長良好，90％細胞可見自律搏動，頻率40-120bpm，心肌細胞成活率和純度均為95％；
　　 2. （1）超聲微泡介導(dǎo)Akt1基因分別轉(zhuǎn)染293FT細胞和新生大鼠心肌細胞實驗結(jié)果 293FT細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果：單純質(zhì)粒組及微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染組未見熒光蛋白表達，僅用超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的C組細胞轉(zhuǎn)染率為4.26％，超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的D組細胞轉(zhuǎn)染率達34.56％ ，約為單用超聲介導(dǎo)基因組轉(zhuǎn)染率的8.1倍。新

10、生大鼠心肌細胞轉(zhuǎn)染率：單純質(zhì)粒組及微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染組未見熒光蛋白表達，僅用超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的C組細胞轉(zhuǎn)染率為2.81％，超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染D組細胞轉(zhuǎn)染率達12.9％，約為單用超聲介導(dǎo)組轉(zhuǎn)染率的4.6倍。超聲探頭從培養(yǎng)皿上方浸入培養(yǎng)液進行超聲輻照E組293FT細胞和新生大鼠心肌細胞轉(zhuǎn)染率分別為35.72％和13.49％ 。超聲探頭從細胞培養(yǎng)皿上方輻照組（E組）與下方輻照組（D組）相比，細胞轉(zhuǎn)染率差別無統(tǒng)計學(xué)意義。超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)基因

11、轉(zhuǎn)染組細胞壞死率高于單用超聲介導(dǎo)組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。超聲探頭從細胞培養(yǎng)皿上方輻照組（E組）與下方輻照組（D組）相比，新生大鼠心肌細胞壞死率差別無統(tǒng)計學(xué)意義，293FT細胞壞死率有統(tǒng)計學(xué)意義。在相同超聲聯(lián)合微泡轉(zhuǎn)染條件下，293FT細胞轉(zhuǎn)染率與壞死率均高于新生大鼠心肌細胞，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）本實驗條件對超聲輻照強度、輻照時間、微泡體積濃度轉(zhuǎn)染參數(shù)優(yōu)化時，結(jié)果顯示超聲輻照強度、超聲輻照時間、微泡體積濃度與轉(zhuǎn)染率呈正相關(guān)，與此

12、同時細胞損傷也漸增多。（3）Akt1基因?qū)毎蛲霰Ｗo結(jié)果： Akt1蛋白表達量: 超聲微泡轉(zhuǎn)染Akt1基因組蛋白表達量高于空白對照組及單純質(zhì)粒組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，空白對照組與單純質(zhì)粒組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。細胞凋亡結(jié)果:超聲微泡轉(zhuǎn)染Akt1基因組凋亡率低于空白對照組和單純質(zhì)粒組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，空白對照組和單純質(zhì)粒組間凋亡率差別比較無統(tǒng)計學(xué)意義。超聲微泡轉(zhuǎn)染Akt1基因組加入Ak1t抑制劑后細胞凋亡率最高，與其他三組間比較，均有統(tǒng)計