雙酚A和雌二醇對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖的影響和機(jī)制研究.pdf

1、甲狀腺癌(thyroid carcinoma，TC)是常見的內(nèi)分泌相關(guān)惡性腫瘤之一，也是全球范圍內(nèi)發(fā)病率上升速度最快的惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)占80％以上。雖然PTC腫瘤被看作是生長(zhǎng)緩慢的腫瘤，主要治療方式為甲狀腺的部分或完全切除，其次通過用放射性碘(131I，RAI)消除殘余甲狀腺癌細(xì)胞組織，這可治愈大多數(shù)TC患者。甲狀腺癌患者術(shù)后需要終身服用甲狀腺激素替代治療，約20-30％的患者發(fā)展為局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，特別是當(dāng)腫瘤

2、失分化并變的失去攝碘能力，以及原發(fā)灶很小就已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，其死亡風(fēng)險(xiǎn)大大增加。當(dāng)然，有一部分微小癌生長(zhǎng)非常緩慢可能生長(zhǎng)很多年未被發(fā)現(xiàn)。目前，甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制并不清楚，積極尋找致病原因及危險(xiǎn)因素深入探討其發(fā)病機(jī)制對(duì)本病的防治至關(guān)重要。
　　已有研究表明雌激素對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用。課題組的前期研究也表明具有雌激素活性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A也可以影響甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。但雌激素及雙酚A對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞遷移及細(xì)胞周

3、期有何影響？這種作用是通過何種受體及信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用的？二者的作用有無差異？這些問題是我們的興趣所在。研究提示雙酚A和雌二醇與甲狀腺癌的關(guān)系將為該病的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 雙酚A和雌二醇對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖能力的影響
　　背景：
　　流行病學(xué)調(diào)查表明，甲狀腺乳頭狀癌的患病率在育齡期女性比同年齡段的男性高出3-4倍，表明甲狀腺癌的發(fā)生可能受到女性性激素，特別是雌激素的影響。甲狀腺腫瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)

4、雜，常見原因可能與家族史、碘的攝入量，電離輻射以及BRAF，RET，NTRK等基因突變有關(guān)。而放射線暴露史和甲狀腺癌家族史，以及BRAF，RET/PTC和NTRK等常見的體細(xì)胞突變并不能解釋甲狀腺癌的發(fā)病的顯著性別差異，碘是甲狀腺激素合成重要原料，缺乏將會(huì)引起甲狀腺功能減退、智力低下、身材矮小。目前國(guó)際上普遍認(rèn)為，甲狀腺癌的病理類型與碘的攝入量無關(guān)，但也有研究顯示碘攝入量高的地區(qū)甲狀腺癌的發(fā)病率增高，尤其是甲狀腺乳頭狀癌，本課題組前期動(dòng)

5、物實(shí)驗(yàn)研究也表明，高碘飲食可誘發(fā)大鼠甲狀腺組織發(fā)生乳頭狀甲狀腺癌，但這也并不能解釋女性甲狀腺癌患病人數(shù)的增多，而性激素參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生似乎是解釋顯著性別差異的合理假說。以前的研究已經(jīng)清楚地表明，雌激素可以影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)，由于在女性月經(jīng)周期，懷孕和哺乳期間，甲狀腺較長(zhǎng)時(shí)間的暴露于較高的雌激素水平環(huán)境中，被認(rèn)為容易患甲狀腺癌。17β-雌二醇(E2)是人類中最有效的雌激素之一，并且對(duì)存在于良性和惡性甲狀腺細(xì)胞中的雌激素受體具有很高的

6、親和力。E2還促進(jìn)雌激素靶器官如乳腺和子宮內(nèi)膜組織的癌性病變。已有研究表明，乳腺癌患者中甲狀腺結(jié)節(jié)性腫大發(fā)生率較高，表明對(duì)于雌激素相關(guān)的器官，有一種共刺激生長(zhǎng)因素參與了甲狀腺腫瘤的病理過程。
　　隨著社會(huì)的發(fā)展、環(huán)境污染的加重，環(huán)境因素對(duì)甲狀腺腫瘤的影響越來越受到人們關(guān)注。具有雌激素特性的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(EDCs)也可能參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。雙酚A(BPA)是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的代表物，由聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的化合組成，存在于

7、塑料，農(nóng)藥，藥物，洗滌劑和化妝品等數(shù)千種消費(fèi)品中。
　　目的:
　　1.檢測(cè)不同濃度的雙酚A和雌二醇對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)增殖活力的影響;
　　2.檢測(cè)最佳濃度的雙酚A和雌二醇對(duì)BHP10-3細(xì)胞遷移和細(xì)胞周期的影響;
　　3.檢測(cè)雙酚A和雌二醇對(duì)BHP10-3細(xì)胞增殖的影響是否是基于雌激素核受體(ERα/ERβ)和膜受體(GPR30)的表達(dá)。
　　方法:
　　1.采用不同濃度的雙酚A

8、(10-3-10-8M)和雌二醇(10-4-10-9M)，干預(yù)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)，在不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)采用CCK-8實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)BHP10-3細(xì)胞增殖活力，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)BHP10-3細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)的變化，確定BPA和E2促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳濃度和時(shí)間。
　　2.采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)判斷雙酚A和雌二醇對(duì)BHP10-3細(xì)胞遷移能力的影響。
　　3.利用最佳濃度的雙酚A和雌二醇干預(yù)BHP10

9、-3細(xì)胞，分別在不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量及計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)，分析BPA及E2對(duì)細(xì)胞周期相的影響;
　　4.采用免疫熒光法確定雌激素核受體(ERα/ERβ)和膜受體(GPR30)在人甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位;
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度的BPA和E2刺激甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)，BPA和E2的促增殖作用表現(xiàn)為倒置的“U”型曲線，呈濃度和時(shí)間依

10、賴性，最佳增殖濃度分別為10-7M和10-8M，活細(xì)胞數(shù)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增多;
　　2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示BHP10-3細(xì)胞在雙酚A和雌二醇的作用下，促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)和遷移。
　　3.流式細(xì)胞細(xì)胞周期相顯示，雙酚A和雌二醇均可促進(jìn)BHP10-3細(xì)胞從G0/G1進(jìn)期展到S期，24h為G0/G1進(jìn)展到S期的最佳時(shí)間。
　　結(jié)論:
　　1.雙酚A具有顯著的雌激素活性，低劑量的雙酚A(BPA，10-7M)和雌二醇(E2，10-8M

11、)即可發(fā)揮其生物學(xué)活性，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移。
　　2.雌激素受體ERα、ERβ和GPR30共同表達(dá)于人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)中，雙酚A和雌二醇一樣促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)的增殖可通過雌激素受體依賴性途徑。
　　第二部分 雙酚和雌二醇誘導(dǎo)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞產(chǎn)生mERα和GPR30及對(duì)AKT/mTOR通路的影響
　　背景:
　　PI3K/Akt通路在致癌過程中的作用已經(jīng)被廣泛的探

12、索和報(bào)道，最近的研究證實(shí)這一途徑與TC，尤其是與FTC和ATC的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切。關(guān)于PI3K/Akt/mTOR通路的激活有多重方式，越來越多的亞臨床或臨床數(shù)據(jù)支持這一途徑可能代表一種治療TC潛在目標(biāo)，而針對(duì)PI3K/Akt/mTOR的口服藥物已成功的治療多種惡性腫瘤，正逐漸被廣泛應(yīng)用。特別是當(dāng)甲狀腺腫瘤對(duì)傳統(tǒng)的放射性碘治療產(chǎn)生抵抗的時(shí)候，即難治性甲狀腺癌的治療，需努力去確定這些途徑中可能的治療目標(biāo)。研究表明雌激素促進(jìn)雌激素反應(yīng)性器官惡

13、性腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能是通過結(jié)合ERs而激活PI3K/Akt/mTOR通路的激活而致。由于甲狀腺乳頭狀癌顯著的性別差異，我們推測(cè)雌激素受體參與了其發(fā)病，而具體哪種受體參與PI3K/Akt/mTOR通路的激活尚不清楚。由于BPA在結(jié)構(gòu)上類似于E2，它是否也可通過雌激素受體依賴性途徑激活該通路仍有待確定。而運(yùn)用單獨(dú)靶向或雙重受體抑制劑是否可抑制該通路的激活也是本文關(guān)注的重點(diǎn)。
　　目的:
　　1.檢測(cè)雙酚A(10-7M)和雌二醇(

14、10-8M)干預(yù)BHP10-3細(xì)胞后，BHP10-3細(xì)胞中ERα、ERβ、GPR30等雌激素相關(guān)受體基因和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　2.明確PI3K/Akt/mTOR通路在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病中的作用，以及明確雙酚A是否類似于雌二醇可激活PI3K/Akt/mTOR通路。
　　3.了解選擇性雌激素受體拮抗劑ICI182，780和特異性GPR30拮抗劑G15是否可通過抑制雌激素受體的表達(dá)而阻斷BHP10-3細(xì)胞PI3K/Akt/m

15、TOR(PAM)通路的激活。
　　4.比較雙酚A和E2在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中的作用差異。
　　方法:
　　1.通過Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)分別在24h和48h檢測(cè)雙酚A(BPA)和雌二醇(E2)干預(yù)后的人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)中ERα、ERβ、GPR30等雌激素相關(guān)受體基因和蛋白表達(dá)水平的變化;
　　2.通過Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)明

16、確選擇性或特異性雌激素受體拮抗劑ICI(10-6M)、G15（10-8M）預(yù)處理BHP 10-3細(xì)胞1h后，是否可抑制雌激素相關(guān)受體基因和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.運(yùn)用Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)再次證實(shí)雙酚A(10-7M)和雌二醇(10-8M)可明顯增強(qiáng)ERα、ERβ和GPR30在BHP10-3細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.雙酚A(10-7M)和雌二醇（10-8M）均可迅速刺激甲狀腺

17、乳頭狀癌細(xì)胞(BHP10-3)中Akt/mTOR發(fā)生磷酸化，最佳時(shí)間均為30分鐘。
　　結(jié)論:
　　1.Akt/mTOR信號(hào)通路參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　2.Akt/mTOR通路的激活可能是基于上游雌激素受體（mER和GPR30）的過表達(dá)而完成。
　　3.ICI可顯著抑制BPA和E2誘導(dǎo)的BHP10-3中ERα的表達(dá)，由于ERα和ERβ的不同作用特點(diǎn)，單獨(dú)應(yīng)用ICI，其拮抗作用表

18、現(xiàn)為不確定性。
　　4.G-15能顯著抑制E2誘導(dǎo)的雌激素受體及下游通路分子的表達(dá)，從而達(dá)到抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，但對(duì)于BPA無抑制作用;ICI和G15對(duì)于E2誘導(dǎo)的GPR30及下游通路分子的表達(dá)具有協(xié)同性。
　　5.BPA和E2類似于特異性激動(dòng)劑G1的作用均可顯著促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖，二者之間比較無顯著性差異。
　　6.BPA可以通過基因組轉(zhuǎn)錄途徑或非基因組途徑促進(jìn)甲狀腺乳頭狀腫瘤的進(jìn)展，但激活雌激素受體的方式