CerS2基因過表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌BCPAP細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響.pdf

1、目的：
　　探討CerS2基因過表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌BCPAP細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響。
　　方法：
　　1）采用pAdxsi重組腺病毒骨架載體構(gòu)建人源重組CerS2腺病毒表達(dá)載體，并確認(rèn)pAdxsi-CerS2-GFP腺病毒表達(dá)載體對(duì)BCPAP細(xì)胞株感染的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）、過表達(dá)高峰時(shí)間；
　　2）將pAdxsi-GFP、pAdxsi- CerS2-GFP腺病毒表達(dá)載體分別感染BCPAP細(xì)胞，培養(yǎng)特定時(shí)間后，

2、分別提取空白組（blank group）、空載組（pAdxsi-GFP）、實(shí)驗(yàn)組（pAdxsi-CerS2-GFP）細(xì)胞總RNA與總蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Q-PCR）、蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測(cè)各組細(xì)胞中CerS2 mRNA、蛋白表達(dá)水平；
　　3）噻唑藍(lán)比色法（MTT）檢測(cè)CerS2基因不同作用時(shí)間對(duì)各組細(xì)胞體外增殖的影響；
　　4）流式細(xì)胞術(shù)PI法分析各組細(xì)胞周期變化；
　　5）Annexin V-APC/

3、7-AAD雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1）經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定，克隆片段大小、序列與NM_022075一致，其感染BCPAP細(xì)胞最佳MOI值為240，最佳作用時(shí)間48h；
　　2）Q-PCR、WB結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞CerS2 mRNA在24h、48h、72h相對(duì)表達(dá)量依次為空白組/空載組的134.57倍、774.26倍、347.29倍（均 P<0.001），其蛋白48h表達(dá)水平也較空白組、空載組明顯增加（P<

4、0.01），空白組與空載組CerS2 mRNA相對(duì)表達(dá)量、蛋白表達(dá)水平均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；
　　3）MTT法檢測(cè)生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)：24h、48h實(shí)驗(yàn)組相對(duì)空載組、空白組，細(xì)胞OD值明顯降低（均P<0.001），空白組與空載組比較細(xì)胞OD值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；
　　4）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞周期，結(jié)果提示：空白組與空載組細(xì)胞周期時(shí)相分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；G0/G1期、S期實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)分別為

5、（40.38±3.43）％、（18.83±1.18）%，空載組細(xì)胞數(shù)分別為（56.63±1.95）%、（27.28±0.52）%，實(shí)驗(yàn)組較空載組G0/G1期、S期細(xì)胞數(shù)下降（均P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞數(shù)（40.79±4.50）%較空載組（16.09±1.44）%明顯增高（P＜0.001）；
　　5）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空載組細(xì)胞凋亡率相對(duì)空白組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率（29.64±0.20）%較空白

6、組（5.70±0.19）%、空載組（6.07±0.17）%明顯增高（均P<0.001）。
　　結(jié)論：本研究采用pAdxsi重組腺病毒骨架載體構(gòu)建pAdxsi-CerS2-GFP人源重組腺病毒表達(dá)載體，成功感染甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞，并分別從mRNA、蛋白層次驗(yàn)證BCPAP細(xì)胞CerS2基因過表達(dá)成功。研究結(jié)果顯示CerS2基因過表達(dá)對(duì)BCPAP細(xì)胞增殖有抑制作用，其主要機(jī)制可能與導(dǎo)致BCPAP細(xì)胞G2/M期阻滯，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)