RNA干擾TFF3基因對人甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖與侵襲的影響及機制研究.pdf

1、甲狀腺癌是頭頸部常見的腫瘤，也是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。甲狀腺癌的發(fā)病率約占甲狀腺腫瘤的5％，占全身惡性腫瘤的1％左右。女性發(fā)病率是男性的3~4倍，是危害女性健康的十大癌種之一。甲狀腺癌死亡率約為6.8/10萬，是死亡率最低的五種癌癥之一。來源于濾泡上皮的分化型甲狀腺癌包括甲狀腺乳頭狀癌和濾泡癌,占甲狀腺癌的90%以上。甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid cancer，PTC)是最常見的病理類型，占甲狀腺癌的80％。

2、
　　當前臨床指南推薦細針穿刺細胞學檢查(Fine needle aspiration,FNA）作為甲狀腺癌最有效的診斷方法。但受到多種因素的影響，如穿刺部位、采集方法和檢測技術的限制，導致約20%的甲狀腺結節(jié)誤診或漏診。因此，尋找準確、敏感的診斷技術如基于分子生物學的診斷技術對甲狀腺癌的個體化醫(yī)療非常必要。甲狀腺癌的標準治療通常包括手術治療、促甲狀腺激素抑制治療,甲狀腺殘體的放射性碘(RAI)治療。盡管甲狀腺癌的預后良好,仍有約

3、5%的患者會出現(xiàn)轉移性疾病,該群體缺乏具體的、有效的治療方法。尋找有效的治療靶點和靶向藥物將助于進一步提高該部分甲狀腺癌的治療效果。
　　三葉因子3(Trefoil factor3，TFF3)是三葉因子家族中發(fā)現(xiàn)最晚的小分子分泌性多肽，人TFF3由42個氨基酸殘基通過二硫鍵折疊而成三葉草結構域。越來越多的證據(jù)表明,TFF3在癌癥的發(fā)生和進展中有至關重要的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TFF3mRNA和蛋白在不同的實體腫瘤過表達，包括乳腺癌、胃癌、

4、前列腺癌和結腸癌、子宮內(nèi)膜癌和肝細胞癌，并促進癌細胞遷移、入侵、增殖、生存和血管生成。然而,Takano等首先發(fā)現(xiàn)甲狀腺濾泡癌中TFF3下調(diào)。隨后科學家以免疫組織化學發(fā)現(xiàn)乳頭狀和未分化癌TFF3蛋白質(zhì)低表達。但本課題組前期工作表明：PTC中TFF3高表達，且與淋巴結轉移和臨床分期有關。本實驗將利用體內(nèi)、外實驗進一步研究 TFF3在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用機制。
　　第一部分甲狀腺乳頭狀癌標本TFF3的表達及臨床意義
　　目的：

5、檢測甲狀腺乳頭狀癌手術標本中TFF3的表達及其與臨床病理參數(shù)的關系，探討TFF3在甲狀腺乳頭狀癌中的臨床意義。
　　方法：商用PTC組織芯片購于上海芯超生物技術有限公司，新鮮手術標本源于2014年河北北方學院附屬第一醫(yī)院甲狀腺癌手術標本。取材前均經(jīng)患者知情同意，標本經(jīng)兩名病理醫(yī)師明確診斷。對組織芯片進行免疫組化染色；新鮮手術標本部分用于原位雜交染色，部分用于RT-PCR法檢測內(nèi)源基因TFF3mRNA的轉錄水平。
　　結果：<

6、br>　　1組織芯片中TFF3蛋白表達
　　31例乳頭狀癌乳頭狀結構明顯，毛玻璃樣核、核型不規(guī)則、核溝明顯可見。陽性產(chǎn)物高表達于胞漿，癌旁濾泡上皮細胞為立方形，TFF3陰性或弱陽性。PTC組織TFF3陽性率和AOD值明顯高于癌旁組織。伴淋巴結轉移的PTC病例TFF3全為陽性（15/15）,無淋巴結轉移者陽性率68.75%（11/16），其表達水平（AOD值）在淋巴結轉移者明顯高于無淋巴結轉移者(P<0.05)。臨床Ⅲ~Ⅳ期患者TF

7、F3的陽性率100%（20/20）明顯高于Ⅰ~Ⅱ期54.54%（6/11）患者(P<0.05)。
　　2 TFF3mRNA原位雜交
　　TFF3mRNA陽性信號為藍色顆粒，位于胞漿。癌組織陽性信號明顯高于癌旁，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　3 PTC中TFF3 RT-PCR結果
　　TFF3mRNA和β-actin的擴增產(chǎn)物分別在100～200bp和200～500bp之間清晰擴增帶。甲狀腺乳頭狀癌TF

8、F3/β-actin比值明顯高于癌旁組織（P<0.01）。
　　小結：
　　1 TFF3蛋白和mRNA在甲狀腺乳頭狀癌上皮細胞高表達。
　　2 PTC中TFF3蛋白高表達與淋巴結轉移和臨床分期有關。
　　第二部分人TFF3 shRNA表達質(zhì)粒的構建及有效序列篩選
　　目的：構建針對人TFF3的shRNA表達載體，瞬時轉染自身表達TFF3的甲狀腺乳頭狀癌K1細胞，篩選出靶向人TFF3的最有效的siRNA序列。

9、
　　方法：
　　1根據(jù)GenBank中登錄的人TFF3mRNA序列，利用Invitrogen公司網(wǎng)站在線設計軟件分別在人TFF3基因mRNA的132?170、258和537bp處作為潛在靶位點，合成4條siRNA轉錄模板的發(fā)夾結構（shRNA1~4）以及1條陰性對照（shRNAC）。按照 Sense+Loop+Antisense+終止信號的原則設計shRNA序列，并由廣州復能基因生物有限公司合成。體外退火后插入pLVX-s

10、hRNA-puro載體構建重組質(zhì)粒，酶切鑒定，并測序。
　　2 shRNAs質(zhì)粒瞬時轉染甲狀腺乳頭狀癌K1細胞，轉染48小時熒光顯微鏡觀察轉染細胞的效率。
　　3轉染shRNA-TFF3后各組細胞Quantitative Real-time PCR(qPCR)和western blot檢測TFF3mRNA和蛋白的沉默效率。
　　結果：
　　1人TFF3shRNA表達載體酶切鑒定
　　pLVX-ShRNA2-

11、puro-TFF3質(zhì)粒用XhoI做酶切鑒定。將鑒定的陽性質(zhì)粒送交公司測序，結果證明shRNA3,4插入序列與原設計序列完全一致, shRNA1，2發(fā)生了突變，后續(xù)實驗舍去。
　　2各組細胞質(zhì)粒轉染后熒光表達結果
　　K1細胞轉染48小時后，倒置熒光顯微鏡觀察顯示，各質(zhì)粒轉染組的細胞中可見明顯的綠色熒光，表明重組質(zhì)粒已成功轉入細胞。其中shRNA3、shRNA4和shRNAC組熒光細胞數(shù)量分別占細胞總數(shù)的(79.83±2.3)

12、%?(71.7±3.0)%?(70.45±2.0)%，各組細胞熒光強度基本一致；未轉染組K1細胞未見熒光?
　　3各組細胞TFF3mRNA表達量分析
　　轉染48h，與shRNAC組相比，shRNA3、shRNA4組TFF3mRNA水平顯著降低（均為P<0.01），qPCR顯示shRNA3和shRNA4組TFF3mRNA沉默效率分別為60.67%和57.33%。
　　4各組細胞TFF3蛋白表達量分析
　　West

13、ern blot結果顯示：shRNA3、shRNA4組TFF3蛋白的表達量明顯低于未轉染組和對照組（P<0.01）。
　　小結：
　　1本實驗成功設計并構建成功2組特異性靶向人TFF3基因的shRNA慢病毒載體。
　　2重組載體瞬時轉染后的兩組K1細胞株，通過qPCR和western blot檢測，在轉錄后和翻譯水平上顯著抑制了TFF3基因的表達，證實所構建的靶向TFF3基因的重組shRNA慢病毒載體是成功、有效的。<

14、br>　　第三部分慢病毒介導shRNA靶向下調(diào)TFF3對人乳頭狀癌TPC-1細胞生物特性的影響
　　目的：構建shRNA靶向下調(diào)TFF3表達的乳頭狀癌TPC-1細胞穩(wěn)轉株；檢測沉默TFF3基因對TPC-1細胞的體外生物學特性的影響及可能的作用機制。
　　方法：
　　1慢病毒包裝293T細胞及病毒滴度測定。
　　2本研究中將采用慢病毒感染法構建乳頭狀癌TPC-1細胞穩(wěn)轉株；并以Quantitative Real-t

15、ime PCR和western blot檢測shRNA-TFF3-TPC-1細胞TFF3的沉默效率。
　　3檢測沉默TFF3對TPC-1細胞生物學特性的影響：克隆形成實驗和CCK-8檢測TFF3基因對TPC-1細胞增殖能力、劃痕實驗及transwell細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力、細胞侵襲實驗檢測侵襲及粘附能力， Quantitative Real-time PCR PCR和免疫印跡檢測凋亡相關指標bax和bcl-2的水平改變。<

16、br>　　結果：
　　1慢病毒包裝和穩(wěn)轉細胞株的篩選
　　shRHAC和shRNA-TFF3慢病毒載體經(jīng)293T細胞包裝后可在熒光顯微鏡493nm下激發(fā)綠色熒光。慢病毒rLV-TFF3滴度為:5.0x107 TU/ml；rLV-shRNAC滴度為:1.0x109 TU/ml。經(jīng)過數(shù)日篩穩(wěn)轉細胞株shRNA-TFF3-TPC-1與空載體穩(wěn)轉株shRNAC-TPC-1細胞發(fā)出明亮的熒光，未轉染的TPC-1無綠色熒光。
　　

17、2 shRNA-TFF3-TPC-1和shRNAC-TPC-1穩(wěn)轉細胞株的鑒定
　　qPCR顯示：沉默組比對照組TFF3mRNA轉錄水平明顯降低（P<0.01）。Western blott結果顯示:與對照組相比shRNA-TFF3干擾組TFF3蛋白的表達顯著降低（P<0.01）。免疫細胞化學染色顯示TFF3蛋白位于細胞質(zhì)，未轉染TPC-1和shRNAC組胞質(zhì)呈TFF3強陽性，shRNA-TFF3干擾組TFF3陽性信號明顯減弱（P<

18、0.01）。
　　3沉默TFF3基因TPC-1細胞增殖能力下降
　　克隆形成實驗結果顯示，未轉染組TPC-1細胞和shRNAC組細胞形成克隆數(shù)目平為(28.7±3.6)個和（33.7±4.1）個，shRNA-TFF3干擾組形成克隆數(shù)目平均為（20.7±2.9）個，與TPC-1和shRNAC組相比克隆形成數(shù)量減少(P<0.05)。
　　CCK-8細胞增殖能力檢測顯示，siTFF3明顯抑制了TFF3細胞的增殖能力。與TPC

19、-1和shRNAC組相比，實驗組shRNA-TFF3細胞株增殖能力明顯受到了抑制(P<0.01)。三組細胞在day2~day4進入對數(shù)生長期，但沉默細胞株shRNA-TFF3在day2~day4的OD值明顯低于正常TPC-1和對照株shRNAC（P<0.01)。
　　4細胞遷移能力
　　通過細胞劃痕修復實驗發(fā)現(xiàn)：劃痕后12h和24h與0h相比，劃痕12h時三組劃痕寬度差異無統(tǒng)計學意義，24hTPC-1、shRNAC和shRN

20、A-TFF3組劃痕寬度分別為26μm、17μm和75μm,shRNA-TFF3組細胞的遷移能力明顯低于shRNAC組及TPC-1組(P<0.01)，而shRNAC組及TPC-1組之間的無差異(P>0.05)。
　　Transwell遷移實驗顯示：shRNA-TFF3組上室細胞穿膜到達下室的細胞明顯少于shRNA組及TPC-1組，10%乙酸洗脫后，酶標儀檢測三組吸光度值，沉默組吸光度值為0.8088±0.0012明顯低于shRNAC

21、組的1.1590±0.009122和TPC-1組的1.1950±0.02800，差異具有統(tǒng)計學意義， P<0.01。
　　5細胞侵襲能力
　　Transwell侵襲實驗結果：與shRNAC組及TPC-1組比較，shRNA-TFF3組上室細胞侵襲到下室的細胞數(shù)明顯下降（P<0.01），shRNAC與TPC-1兩組間無顯著性差異（P>0.05）。10%乙酸洗脫后，酶標儀檢測三組吸光度值，shRNA-TFF3沉默組明顯低于shRN

22、AC組及TPC-1組。
　　6細胞粘附能力
　　三組細胞培養(yǎng)2h后吸棄未粘附的細胞后，貼壁細胞經(jīng)CCK-8法檢測各組OD值，結果：三組細胞株總體粘附性有差異。其中，shRNA-TFF3粘附率為5.16%，顯著低于shRNA（P<0.05）。
　　7 TFF3基因沉默促進TPC-1凋亡
　　(1) qPCR檢測bcl-2、bax基因轉錄水平
　　qPCR結果顯示：三組細胞均檢測到了bcl-2 mRNA、bax

23、 mRNA的表達，對數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)shRNA-TFF3組促凋亡基因bax明顯高于對照組shRNAC,而抗凋亡基因bcl-2則低于對照組，均為P<0.01。
　?。?）BCL-2和 BAX蛋白水平變化
　　Western blot法檢測結果提示：shRNA-TFF3組與shRNAC組和TPC-1組相比，BCL-2蛋白明顯減弱，BAX蛋白明顯增強。差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）TUNEL原位凋亡

24、　　TUNEL染色陽性細胞細胞體積縮小，核固縮，染色質(zhì)凝聚，呈棕黃色或黃褐色顆粒，胞質(zhì)著色淺，呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學特征。shRNA-TFF3組TUNEL陽性細胞數(shù)多于shRNAC組及TPC-1。
　　小結：
　　1通過慢病毒侵染方法成功構建了敲低表達TFF3的甲狀腺乳頭狀癌shRNA-TFF3-TPC-1細胞株。
　　2 TFF3基因沉默可以降低TPC-1細胞的體外增殖、遷移及侵襲能力，并促進細胞凋亡。
　　3 TF

25、F3基因沉默促進bcl-2下調(diào)，bax上調(diào)。
　　第四部分shRNA-TFF3-TPC-1細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤作用
　　目的：裸鼠皮下接種人 TPC-1細胞株，制作人甲狀腺乳頭狀癌細胞裸鼠模型,觀察TFF3基因沉默后對裸鼠體內(nèi)腫瘤組織生長能力的影響，在體驗證shRNA沉默TFF3基因的生物學效應。
　　實驗動物分組。
　　方法：
　　1實驗分組
　　36只裸鼠，雌雄各半，隨機分為三組，即正常對照組：裸

26、鼠右側腋窩中部外側皮下注射 TPC-1細胞?？蛰d體 shRNAC組：裸鼠皮下注射shRNAC- TPC-1細胞懸液?；虺聊?shRNA-TFF3組：裸鼠皮下注射shRNA-TFF3-TPC-1細胞懸液。
　　2細胞體外培養(yǎng)
　　三組TPC-1細胞在5％CO2、37℃正常條件下培養(yǎng)。制成1~2×105個細胞／ml的細胞懸液，待種。
　　3瘤細胞懸液接種及瘤體觀察
　　75%醫(yī)用酒精棉球消毒裸鼠右腋下皮膚，搖勻細胞

27、懸液，取0.2ml（細胞數(shù)5×105）緩慢注射于小鼠右腋部皮下。每日觀察小鼠狀態(tài)和移植瘤發(fā)生及生長情況。記錄三組移植瘤發(fā)生時間點，隔2日稱重測量腫瘤一次，并用游標卡尺測量瘤體大小，繪制裸鼠移植瘤體積生長曲線。
　　4繼續(xù)飼養(yǎng)并連續(xù)觀察裸鼠情況，于最后一次腫瘤測量后，移出無菌層流室，每組各取雌雄各3只行小動物活體成像然后安樂死處死動物。取出腫瘤標本，拍照；取癌組織塊，稱重后，切取2/3凍存于-80℃冰箱,其余部分制作蠟塊。
　

28、　5 HE染色及免疫組化染色
　　瘤體經(jīng)bouin’s液固定12h，逐級梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋。切片厚5?m、HE染色。
　　6腫瘤組織RNA提取及Quantitative Real-time PCR，檢測TFF3干擾表達TPC-1腫瘤中TFF3mRNA水平
　　結果：
　　1裸鼠生長狀態(tài)
　　三組細胞移植后TPC-1組和shRNAC組第7天成瘤，shRNA-TFF3組第10天成瘤。各

29、組裸鼠1～3周生長狀態(tài)良好，活動、進食均無異常，體重穩(wěn)步增長，第3周體重停止增長或增長緩慢。
　　2 shRNA-TFF3對TPC-1細胞移植瘤生長的影響
　　第7天TPC-1組和shRNAC組開始觸及瘤體,TFF3沉默組第10天開始成瘤,并快速生長。但TFF3沉默組裸鼠皮下移植瘤不僅成瘤滯后，而且生長速度明顯滯后于其余兩組。小動物活體成像可見瘤體發(fā)出綠色熒光。shRNA-TFF3與shRNAC組相比瘤體小，且熒光強度弱。雄

30、性鼠瘤體大于雌性。
　　第28天,shRNA-TFF3組裸鼠腫瘤體積明顯小于shRNAC組和TPC-1組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果表明，敲低TFF3基因的表達能明顯抑制裸鼠移植瘤模型中TPC-1細胞的成瘤能力和腫瘤的生長能力（P<0.05)。
　　3. TFF3基因敲低對移植瘤重量的影響
　　在第28天觀察期結束后，將各組裸鼠處死，完整切取皮下腫瘤的瘤體。稱取三組腫瘤的重量。shRNA-TFF3組瘤體的

31、重量明顯低于未轉染組和空載體組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。
　　4.瘤體HE染色及免疫組織化學染色
　　HE染色結果顯示瘤組織為癌細胞特點，可見病理性多核及核分裂相，細胞間可見少許結締組織。TFF3免疫組化染色可見免疫反應陽性細胞胞質(zhì)呈黃色或棕黃色，shRNAC和TPC-1組TFF3陽性信號強，shRNA-TFF3組幾乎陰性。各組瘤內(nèi)TFF3蛋白比較:與未轉染組和shRNAC組比較， shRNA-TFF3組蛋白表達

32、顯著降低，而未轉染組和shRNAC組間無統(tǒng)計學差異（P<0.01)。
　　5移植瘤組織中TFF3mRNA水平
　　移植瘤qPCR結果顯示：沉默TFF3基因組TFF3mRNA水平低于未轉染組和shRNAC組（P<0.01)。穩(wěn)定敲低TFF3的TPC-1細胞在裸鼠體內(nèi)穩(wěn)定，與體外沉默相近。
　　小結：
　　1甲狀腺乳頭狀癌TPC-1裸鼠移植模型成功建立。
　　2在體內(nèi)實驗，敲低TFF3基因表達的TPC-1細胞能

33、顯著抑制腫瘤增長。乳頭狀癌 TPC-1細胞裸鼠模型的體內(nèi)實驗結果同體外細胞學功能實驗結果一致。
　　結論：
　　1甲狀腺乳頭狀癌高表達TFF3與淋巴結轉移及臨床分期有關。
　　2敲低內(nèi)源性TFF3表達，乳頭狀癌的TPC-1細胞生長受抑制、侵襲能力降低，體內(nèi)、外成瘤能力降低，可能通過促進 bcl-2下調(diào)，bax上調(diào)促進TPC-1細胞凋亡影響細胞的生物學特性。
　　3 TFF3基因可以作為人類甲狀腺乳頭狀癌潛在的治療