E64d對oxLDL致人主動脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用研究.pdf

1、目的:
　　動脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)代謝不平衡的慢性炎癥性疾病。內(nèi)皮細胞覆蓋在血管壁表層，形成了一道防御動脈粥樣硬化的天然屏障。當內(nèi)皮細胞暴露于高血壓、高血糖、高血脂等危險因素時會發(fā)生內(nèi)皮功能障礙，降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)表達、增加炎性粘附分子產(chǎn)生、破壞細胞遷移能力。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxL

2、DL)作為血脂升高的關(guān)鍵成分，通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙。E64d是木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（如組織蛋白酶B，CTSB）的小分子抑制劑。因此，E64d涉及自噬溶酶體活動的調(diào)節(jié)。已有研究表明E64d對多種臨床前期病理模型有效，如動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、腦缺血、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性骨髓瘤等。在大鼠腦缺血模型中，E64d能減弱神經(jīng)血管內(nèi)皮凋亡。E64d能夠阻斷細胞外彈性蛋白降解。彈性蛋白降解對動脈粥樣硬化過程中的管壁重構(gòu)十分重要。這

3、些研究表明E64d可能具有保護內(nèi)皮細胞、防止動脈粥樣硬化的作用。然而目前E64d對內(nèi)皮功能障礙的作用仍不清楚。因此，本實驗要探究E64d對oxLDL誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細胞功能障礙的作用及潛在機制。
　　方法:
　　1.實驗分組
　　在oxLDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷模型建立中，將人主動脈內(nèi)皮細胞分為五組，分別用0、50、100、150、200mg/L oxLDL處理內(nèi)皮細胞24小時，觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)、活力、氧化應(yīng)激、炎性粘附

4、因子、eNOS蛋白表達和自噬水平的變化;在E64d干預(yù)氧化損傷內(nèi)皮細胞實驗中，先將人主動脈內(nèi)皮細胞分為五組，分別以對照組、150mg/L oxLDL組、150mg/L oxLDL+1μM E64d組、150mg/L oxLDL+5μM E64d組、150mg/L oxLDL+10μM E64d組處理內(nèi)皮細胞24小時，根據(jù)細胞活力檢測結(jié)果選出E64d最佳干預(yù)濃度后，再將人主動脈內(nèi)皮細胞分為三組，分別以對照組、150mg/L oxLDL組、

5、150mg/L oxLDL+1μM E64d組處理內(nèi)皮細胞24小時，檢測內(nèi)皮細胞凋亡、炎性粘附分子、eNOS蛋白表達和遷移能力的變化;在探討E64d對自噬影響的實驗中，將人主動脈內(nèi)皮細胞分為三組，分別以對照組、150mg/L oxLDL組、150mg/L oxLDL+1μM E64d組處理內(nèi)皮細胞24小時，檢測內(nèi)皮細胞中溶酶體組織蛋白酶B的表達、細胞自噬水平(LC3、p62、Beclin1的蛋白表達)、LC3熒光點、細胞超微結(jié)構(gòu)和氧化應(yīng)

6、激水平的變化。
　　2.CCK-8檢測細胞活力
　　CCK-8細胞增殖實驗用于檢測oxLDL和（或）E64d對細胞活力的影響。以適當密度將細胞均勻接種于96孔板中，37℃孵育12小時。用不同濃度的oxLDL(0mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L)或150mg/L oxLDL以不同時間點(0h，6h，12h，24h，48h)或150mg/L oxLDL加不同濃度的E64d(1μM、5μM、1

7、0μM)處理人主動脈內(nèi)皮細胞。加入10μL/孔CCK-8試劑，37℃孵育4小時后，用酶標儀在450nm波長處檢測吸光度值。根據(jù)各組吸光度值與對照組的比值得出細胞活力。
　　3.酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清中的氧化應(yīng)激標志(MDA、SOD)和炎性粘附分子標志(sICAM-1)
　　不同濃度的oxLDL和（或）E64d處理細胞24小時后，收集培養(yǎng)上清。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗細胞，用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞后離

8、心再重懸。用細胞計數(shù)板計數(shù)各組細胞數(shù)。按照ELISA試劑盒中的說明檢測各組培養(yǎng)上清中的MDA、SOD和sICAM-1濃度。
　　4.劃痕實驗檢測細胞遷移
　　將細胞接種于6孔板，待細胞生長到單層融合時用10～20μL塑料槍頭尖端劃痕細胞，并在6孔板蓋上作標記，光鏡拍照。用培養(yǎng)基輕輕沖去細胞碎片，以對照組、150mg/L oxLDL組和150mg/L oxLDL+1μM E64d組37℃孵育細胞24小時。用光鏡以6孔板蓋上標記

9、再次拍照，與不同時間點對比。劃痕大小用Image-Pro Plus軟件分析。
　　5.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡
　　收集對照組、150mg/L oxLDL組和150mg/L oxLDL+1μM E64d組37℃孵育24小時后各組的所有細胞，離心（2000轉(zhuǎn)份，5分鐘），洗滌細胞2次。加入5μL FITC混勻，再加入5μL PI混勻，于室溫避光孵育5～15分鐘，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況

10、。
　　6.免疫熒光檢測自噬標記LC3點
　　細胞在蓋玻片上生長到70％融合時以對照組、150mg/L oxLDL組和150mg/L oxLDL+1μM E64d組37℃孵育細胞24小時。用PBS輕輕沖洗細胞，4％多聚甲醛固定30分鐘。再次用PBS沖洗后，用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉15分鐘。PBS沖洗細胞后，用PBS-3％BSA以1∶200稀釋LC3一抗，4℃孵育過夜。熒光二抗染色后，細胞在室溫下避光孵育30

11、分鐘。PBS沖洗后在共聚焦熒光顯微鏡下拍照觀察。
　　7.透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)
　　將細胞接種于T75塑料培養(yǎng)皿，以對照組、150mg/L oxLDL組和150mg/L oxLDL+1μM E64d組37℃孵育細胞24小時。收集各組細胞，離心（1000轉(zhuǎn)/分，10分鐘，4℃），在4％戊二醛中4℃固定過夜，通過處理后用透射電鏡觀察。
　　8.Western Blot檢測內(nèi)皮細胞中LC3、p62、Beclin1、

12、eNOS和組織蛋白酶B(CTSB)的蛋白表達
　　運用不同濃度oxLDL和（或）E64d處理內(nèi)皮細胞24小時后，收集各組細胞。用BCA蛋白分析法進行蛋白濃度測定。取蛋白20μg上樣于8％或15％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SD S-PAGE)進行電泳，轉(zhuǎn)膜于PVD膜上。用5％脫脂奶粉封閉1小時后按照1∶1000稀釋LC3，1∶1000稀釋p62、1∶1500稀釋Beclin1，1∶200稀釋eNOS，1∶2000稀釋CTSB，

13、1∶800稀釋β-actin一抗抗體，于4℃孵育過夜。取對應(yīng)二抗室溫孵育1小時后洗膜，用電化學(xué)發(fā)光法，將膜于成像系統(tǒng)中拍照。應(yīng)用ImageJ軟件分析電泳條帶的灰度值。
　　結(jié)果:
　　1.oxLDL誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙、降低自噬流
　　2.E64d減輕oxLDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙
　　3.E64d降低oxLDL誘導(dǎo)的自噬及氧化應(yīng)激
　　結(jié)論:
　　E64d改善oxLDL誘導(dǎo)的與sICAM-1、eNOS、M