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文檔簡介
1、研究背景與目的:
炎癥在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病過程中起重要作用。動脈粥樣硬化的各個過程均有炎癥介質(zhì)如各種粘附分子等參與炎癥反應(yīng)。減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷的炎癥反應(yīng)是緩解動脈粥樣硬化的重要途徑。目前,研究顯示人類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙?;?(SIRT3)在能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌細(xì)胞肥大、長壽等機(jī)制方面發(fā)揮重要作用,但其在動脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞損傷反應(yīng)過程中的作用國內(nèi)外少見報道。因此,本研究旨在探討人SIRT3與內(nèi)
2、皮細(xì)胞損傷過程中炎性因子的調(diào)控關(guān)系,進(jìn)一步揭示SIRT3在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的作用。
研究方法:
1.干擾序列的篩選
(1)人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng):人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞,用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基+1%內(nèi)皮生長因子+5%胎牛血清的培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下貼壁培養(yǎng),選擇3-7代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
(2)分組與轉(zhuǎn)染:將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染試劑對照組、SIRT3
3、siRNA(1、2、3、4)組。待細(xì)胞70%-80%融合時用轉(zhuǎn)染試劑hiperfect進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑對照組只加轉(zhuǎn)染試劑不加干擾序列。陰性對照組添加陰性對照序列和轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染24h后檢測相關(guān)指標(biāo)。
(3)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
(4)熒光倒置顯微鏡觀察陰性對照組熒光蛋白表達(dá)。
(5)qRT-PCR檢測各組SIRT3 mRNA表達(dá)。
(6)Western blot檢測各組SIRT3蛋白質(zhì)的表達(dá)
4、。
2、SIRT3干擾后檢測ox-LDL刺激的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞SIRT3 mRNA,ICAM-1、E-selectin蛋白的表達(dá)。
(1)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為空白對照組、siRNA組、(20、30、40μg/mL)ox-LDL組、siRNA+(20、30、40μg/mL)ox-LDL組。ox-LDL各組分別按濃度加入ox-LDL刺激6h;siRNA為篩選出的最佳SIRT3干擾序列,siRNA+ox-LDL組為轉(zhuǎn)染24h后加入
5、ox-LDL刺激6h。
(2)qRT-PCR檢測各組SIRT3 mRNA的表達(dá)。
(3)流式細(xì)胞儀檢測ICAM-1、E-selectin抗體的平均熒光強(qiáng)度值。
結(jié)果:
1.干擾序列篩選結(jié)果
(1)光學(xué)顯微鏡下,與空白對照組相比,SIRT3 siRNA各組的細(xì)胞多數(shù)體積增大,細(xì)胞均質(zhì)性降低,細(xì)胞間隙增大。這些特征在SIRT3 siRNA2組較明顯。
(2)與光學(xué)顯微鏡下同一視野對
6、比,陰性對照90%以上細(xì)胞顯示綠色熒光。
(3)與各對照組相比,4條SIRT3 siRNA序列均在不同程度上下調(diào)了SIRT3mRNA的表達(dá)(P均<0.05)。其中:SIRT3 siRNA2組干擾效果最好,沉默效率為88.616%。
(4)4個SIRT3 siRNA組分別與各對照組相對灰度值相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。其中:SIRT3 siRNA2組干擾效果最為顯著,沉默效率為:80.372%。
7、 2.SIRT3干擾后不同濃度ox-LDL刺激,SIRT3 mRNA,ICAM-1、E-selectin蛋白表達(dá)
(1)與空白對照組相比,ox-LDL各濃度組的SIRT3 mRNA相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05);且隨ox-LDL濃度增加,mRNA表達(dá)逐漸降低(P均<0.05)。與空白對照組相比,siRNA組的SIRT3 mRNA相對表達(dá)量明顯降低(P<0.001)。siRNA+ox-LDL各組的SIRT3 m
8、RNA相對表達(dá)量與siRNA組相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。
(2)與空白對照組相比,siRNA組及ox-LDL各濃度組的ICAM-1MFI均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。與siRNA組相比,siRNA+ox-LDL各組的ICAM-1MFI差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05);隨著ox-LDL濃度增加,siRNA+ox-LDL各組的ICAM-1MFI依次明顯增加(P均<0.05)。
(3)與空白對照組相比,s
9、iRNA組及20、30μg/mL ox-LDL組的E-selectin MFI無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05),40μg/mL ox-LDL組的E-selectin MFI顯著增加(P<0.05)。與siRNA組相比,siRNA+ox-LDL各組的E-selectin MFI差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05);且隨著ox-LDL濃度的增加,siRNA+ox-LDL各組的E-selectin MFI依次明顯增加(P均<0.05)。
10、 結(jié)論:
1、本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究成功篩選了SIRT3基因小干擾RNA序列。準(zhǔn)確沉默SIRT3基因,為研究人SIRT3與其他基因的調(diào)控關(guān)系提供便利。
2、通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),較低濃度ox-LDL刺激時,人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞SIRT3基因表達(dá)顯著增高;隨ox-LDL濃度進(jìn)一步增加,SIRT3表達(dá)反而降低。提示SIRT3作為保護(hù)因子存在代償作用,但其代償作用受到ox-LDL濃度的限制。
3、SIRT3基因與ox-LDL
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