含氫培養(yǎng)液對(duì)脂多糖(LPS)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:膿毒癥是一種由感染因素誘發(fā)的、以炎癥反應(yīng)為主的綜合癥，嚴(yán)重時(shí)伴有臟器功能障礙，是非心臟重癥監(jiān)護(hù)室住院病人的最常見(jiàn)死因，尚無(wú)有效的治療措施。膿毒癥時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞被過(guò)度、持續(xù)、廣泛激活，其作為炎癥反應(yīng)的靶細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)持續(xù)的同時(shí)，其自身嚴(yán)重?fù)p傷，最終導(dǎo)致器官穩(wěn)態(tài)破壞，甚至功能衰竭。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為膿毒癥治療的靶點(diǎn)具有重要意義。氫氣具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及信號(hào)調(diào)節(jié)作用，可治療多種疾病，如缺血再灌注引起的腦、心、肝

2、、肺、腎損傷，神經(jīng)退行性疾病，糖尿病等。前期研究發(fā)現(xiàn)氫氣吸入對(duì)膿毒癥小鼠具有明顯的保護(hù)作用，其具體機(jī)制尚不清楚。本文擬在前期研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，探討含氫培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用以及相關(guān)機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 方法:離體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12，以1×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板或以1×106/mL接種于6孔培養(yǎng)板，200μL/孔或3 mL/孔。
　

3、　 第一部分:分別以濃度為0μg/mL、0.25μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL及4.0μg/mL的LPS刺激細(xì)胞，孵育24 h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇適宜的LPS刺激濃度，建立細(xì)胞損傷模型。分別以濃度為0.15 mmol/L、0.3 mmol/L及0.6 mmol/L的含氫培養(yǎng)液處理細(xì)胞，測(cè)定24 h后細(xì)胞活性及LDH釋放率，根據(jù)結(jié)果選擇最佳含氫培養(yǎng)液濃度。
　　

4、第二部分:根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本部分實(shí)驗(yàn)選擇LPS刺激濃度為1μg/mL，含氫培養(yǎng)液濃度為0.6 mmol/L（飽和氫培養(yǎng)液）。細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組（C組）、氫氣組（H2組）、LPS組和LPS+H2組。C組和LPS組用正常培養(yǎng)液培養(yǎng);H2組和LPS+H2組用飽和氫培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)LPS組和LPS+H2組加入1μg/mL LPS，而C組和H2組加入等容量的生理鹽水。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定孵育24 h后細(xì)胞凋亡及ICAM-1及VCAM

5、-1表達(dá)情況;應(yīng)用相應(yīng)試劑盒測(cè)定孵育3h、6h、12h和24 h后細(xì)胞上清液中MDA水平。
　　 第三部分:實(shí)驗(yàn)分組同第二部分。應(yīng)用相應(yīng)試劑盒分別測(cè)定孵育3h、6h、12h和24 h后細(xì)胞上清液中SOD、CAT活性;分別應(yīng)用免疫熒光及Western Blot技術(shù)檢測(cè)孵育24 h后Nrf2核移位及蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:MTT結(jié)果顯示:1μg/mL濃度LPS作用24h即可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，

6、與正常細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞被LPS干預(yù)后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，LPS濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率成正比，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)選擇LPS的刺激濃度為1μg/mL。含氫培養(yǎng)液對(duì)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞增值活性及LDH釋放無(wú)明顯影響(P＞0.05)，可以顯著改善LPS所致血管內(nèi)皮細(xì)胞活性降低及LDH釋放，且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)。提示最佳含氫培養(yǎng)液濃度為0.6mmol/L，即飽和氫培養(yǎng)液。
　　 第二部分:采用1μg/mL濃度L

7、PS刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡顯著增加，其凋亡細(xì)胞率、細(xì)胞表面ICAM-1及VCAM-1表達(dá)較C組和H2組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而LPS+H2組凋亡細(xì)胞率、細(xì)胞表面ICAM-1及VCAM-1表達(dá)較LPS組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);于孵育后3h、6h、12h和24 h，LPS組細(xì)胞上清液中MDA水平較C組和H2組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與LPS組相比，LPS+H2組

8、MDA水平于各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 第三部分:于孵育后3h、6h、12h和24 h， LPS組細(xì)胞上清液中SOD及CAT活性較C組和H2組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與LPS組相比，LPS+H2組SOD及CAT活性于各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在Nrf2免疫熒光染色中，LPS組細(xì)胞核中Nrf2熒光強(qiáng)度較C組和H2組無(wú)明顯差別，LPS+H2組Nrf2