EGFR信號通路通過 Egr2促進骨祖細胞增殖并抑制骨祖細胞凋亡的實驗性研究.pdf

1、骨組織結構完整性的維持依賴于骨祖細胞池中成骨細胞的不斷更新,該生物學過程由許多生長因子進行精細調(diào)控。表皮生長因子受體(EGFR)配體是目前已知的骨祖細胞有絲分裂原。但這些配體調(diào)節(jié)骨祖細胞池的具體機制沒有得到詳細闡述,尤其是EGFR信號通路在調(diào)節(jié)骨祖細胞凋亡中的作用沒有得到詳細研究。在本研究中,證實了EGFR信號通路的激活通過促進骨祖細胞增殖并抑制骨祖細胞凋亡,增加骨祖細胞數(shù)量。該結論在大鼠顱骨組織器官培養(yǎng)實驗中得到進一步證實。在大鼠顱骨

2、組織器官培養(yǎng)實驗中,表皮生長因子(EGF)在增加增殖細胞數(shù)量的同時,降低了凋亡細胞數(shù)量,從而增加成骨細胞總數(shù)量。骨祖細胞系 MC3T3細胞 Microarray分析提示,EGFR信號通路能誘導抗凋亡基因 Mcl1以及早期生長反應基因(Egr1,Egr2,Egr3)的表達。過表達 Egrs的抑制蛋白 Nab2可抑制EGF誘導的骨祖細胞數(shù)量增加。進一步實驗表明,以 SiRNA降低 Egr2的表達,可抑制EGF誘導的骨祖細胞數(shù)量增加,而以 S

3、iRNA降低 Egr1、Egr3的表達,則對 EGF誘導的骨祖細胞數(shù)量增加沒有影響。進一步研究證實 Egr2是 EGF促進骨祖細胞增殖并抑制骨祖細胞凋亡的主要介導基因。采用腺病毒過表達、抑制劑以及SiRNA等實驗方法,我們證實了EGFR信號通路激活 MAPK/Erk通路,進而誘導 Egr2的表達,從而導致了Mcl1的增加,最終抑制細胞凋亡。同時,另一骨祖細胞有絲分裂原和存活因子成纖維細胞生長因子(FGF)2,也能通過誘導 Egr2的表達

4、,進而促進骨祖細胞增殖,抑制骨祖細胞凋亡。這些結果表明,Egr2在生長因子介導的骨祖細胞數(shù)量增加中起著重要作用。總的來說,實驗結果清楚地說明了EGFR信號傳導通路,通過誘導 Egr2的表達,促進骨祖細胞增殖,抑制骨祖細胞凋亡,進而在調(diào)節(jié)骨祖細胞庫的生物學功能中,起著重要的作用。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 EGFR信號通路促進骨祖細胞增殖并抑制骨祖細胞凋亡
　　目的:檢測 EGFR信號通路對骨祖

5、細胞增殖和凋亡的影響。
　　方法:將成骨細胞系MC3T3細胞或大鼠原代顱骨成骨細胞培養(yǎng)于含0.5％FBS培養(yǎng)基內(nèi),分別給予EGFR配體(實驗組)或等體積EGFR配體溶解液(對照組),以細胞計數(shù)法連續(xù)檢測MC3T3細胞總數(shù)。同時,以BrdU法檢測MC3T3細胞或大鼠原代顱骨成骨細胞在實驗組和對照組中的增殖情況,并以EB/AO染色法檢測在血清剝奪及TNFα誘導時,這兩組中MC3T3細胞或大鼠原代顱骨成骨細胞的細胞凋亡情況。同時,分別以

6、EGFR特異性抑制劑吉非替尼(Gefitinib,GEF)、MEK1/2信號傳導途徑特異性抑制劑U0126、PI3K信號傳導途徑特異性抑制劑喔曼青霉素(Wortmannin,WM)以及p38信號傳導途徑抑制劑SB預處理細胞,初步探討EGFR信號通路影響骨祖細胞增殖和凋亡的機制。與此同時,取第五代骨祖細胞/成骨細胞特異性EGFR敲除小鼠(3.6kb collagen1a1-Cre EgfrWa5/flox小鼠)及其野生型同科小鼠原代骨髓間

7、質干細胞,以流式細胞學(Flow Cytometry)分析其細胞特性,并以EB/AO染色法檢測EGF對血清剝奪或TNFα誘導的骨髓間質干細胞凋亡的影響。
　　結果:細胞計數(shù)法結果顯示,與對照組相比,實驗組中MC3T3細胞或大鼠原代顱骨成骨細胞總數(shù)明顯增加。BrdU法檢測顯示,實驗組中增殖 MC3T3細胞或大鼠原代顱骨成骨細胞的數(shù)量顯著高于對照組。同時,EB/AO染色法結果顯示,實驗組中血清剝奪或 TNFα誘導的MC3T3細胞或大鼠

8、原代顱骨成骨細胞凋亡細胞數(shù)量較對照組顯著減少。抑制劑實驗顯示,EGF促進細胞增殖依賴于 MAPK/Erk和PI3K/Akt兩條信號傳導途徑,而EGF抑制血清剝奪或 TNFα誘導的MC3T3細胞或大鼠原代顱骨成骨細胞凋亡僅依賴于 MAPK/Erk信號傳導途徑而不依賴于 PI3K/Akt信號傳導途徑。流式細胞學分析顯示,第五代骨祖細胞/成骨細胞特異性 EGFR敲除小鼠(3.6kb collagen1a1-Cre EgfrWa5/flox小鼠

9、)及其野生型同科小鼠原代骨髓間質干細胞細胞表面表達有干細胞標志物(Sca1+CD29+CD45-)。EB/AO染色顯示,在野生型小鼠原代骨髓間質干細胞中,EGF對血清剝奪或 TNFα誘導的細胞凋亡有抑制作用,而在骨祖細胞/成骨細胞特異性 EGFR敲除小鼠骨髓間質干細胞中,EGF對血清剝奪或 TNFα誘導的細胞凋亡沒有影響。
　　結論:EGFR信號通路可以促進骨祖細胞增殖,抑制骨祖細胞凋亡。其促進骨祖細胞增殖機制依賴于 MAPK/E

10、rk和PI3K/Akt兩條信號傳導途徑,而抑制骨祖細胞凋亡機制僅依賴于 MAPK/Erk信號傳導途徑。
　　第二部分 EGFR信號通路促進顱蓋骨組織器官內(nèi)成骨細胞系細胞增殖并抑制其凋亡
　　目的:探討 EGFR對顱蓋骨組織器官內(nèi)成骨細胞系細胞增殖和凋亡的影響。
　　方法:將新生小鼠顱蓋骨組織器官分別于含有10％FBS的生長培養(yǎng)基(FBS組)、含或等體積EGF溶劑(1mg/ml BSA in1 mM Acetic Aci

11、d)無FBS生長培養(yǎng)基(對照組)和含有50ng/ml EGF的無FBS生長培養(yǎng)基(實驗組)內(nèi)培養(yǎng)7天。經(jīng)脫鈣處理后,將標本進行石蠟包埋并切片。行蘇木精伊紅(Hematoxylin&Eosin, H&E)染色,檢測器內(nèi)成骨細胞數(shù)量。同時,行Ki67、TUNEL、TRAP免疫組化染色,以檢測組織內(nèi)增殖細胞、凋亡細胞以及破骨細胞數(shù)量。
　　結果:培養(yǎng)7天后,在FBS組中,顱蓋骨組織器官可見較多成骨細胞,且顱蓋骨形態(tài)良好。在對照組中,可見

12、顱蓋骨組織器官中的成骨細胞數(shù)量明顯減少,顱蓋骨厚度變薄,形態(tài)較差。在EGF組內(nèi),可見大量成骨細胞,其成骨細胞含量甚至高于FBS組,且該處理組顱蓋骨較厚,形態(tài)良好。EGF組中成骨細胞數(shù)量與對照組相比,有明顯差異。Ki67免疫組化染色顯示,EGF組內(nèi),顱蓋骨組織的增殖細胞數(shù)顯著高于對照組組。同時,TUNEL免疫組化染色結果顯示,EGF能顯著降低顱蓋骨組織中凋亡細胞的數(shù)量。此外,破骨細胞TRAP染色提示,EGF還可維持顱蓋骨組織中破骨細胞數(shù)量

13、。
　　結論:在顱蓋骨組織器官培養(yǎng)中,EGFR信號通路可以促進成骨細胞增殖,抑制其凋亡,同時,對維持破骨細胞數(shù)量也有重要作用。
　　第三部分 EGFR信號通路通過 MAPK/Erk/Egr2信號傳導途徑介導凋亡
　　目的:探討 EGF促進骨祖細胞增殖并抑制骨祖細胞凋亡的具體機制。
　　方法:以50ng/ml EGF刺激 MC3T3細胞,并收集1小時、4小時和24小時 RNA標本進行微陣列分析(Microarray

14、 Analysis),尋找 EGF調(diào)節(jié)的凋亡相關基因以及EGF上調(diào)最多的基因。再以 qRT-PCR,Western Blotting檢測這些基因的mRNA及蛋白表達。同時,應用SiRNA技術以及腺病毒過表達技術,研究這些基因在骨祖細胞內(nèi)的生物學效應。
　　結果:微陣列分析顯示,Mcl1是唯一受 EGF調(diào)節(jié)的凋亡相關基因。EGF可誘導 Mcl1 mRNA水平和蛋白水平的表達。該表達可被 EGFR特異性抑制劑吉非替尼(Gefitini

15、b, GEF)和MAPK/Erk信號傳導途徑特異性抑制劑 U0126所抑制。EGR1,2和3是 EGF刺激后骨祖細胞內(nèi) mRNA水平表達增強的一組即早反應基因。EGF可誘導 EGRs mRNA水平和蛋白水平的表達,其表達峰值在30分鐘至1小時。EGF誘導 EGRs表達也可被 EGFR特異性抑制劑吉非替尼(Gefitinib)和MAPK/Erk信號傳導途徑特異性抑制劑 U0126所抑制。過表達 Egrs轉錄共抑制因子 Nab2或以 SiR