辛伐他汀抑制骨細胞凋亡并促進骨再生的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　1、通過動物實驗的方法，并從醫(yī)學影像學、組織病理學、分子生物學等多個角度，探討辛伐他汀在大鼠脛骨開放截骨模型骨愈合過程中所起的作用，并重點觀察辛伐他汀對骨細胞凋亡的作用情況，為后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。
　　2、通過SD大鼠原代骨細胞分離培養(yǎng)，驗證辛伐他汀、骨細胞凋亡及骨硬化蛋白、RANKL的表達之間的關(guān)系，并初步探討這之間可能的分子機制，從而為該藥物在骨科臨床上的應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。
　　方法:

2、>　　一、動物實驗
　　1、載辛伐他汀克氏針的制備
　　160mg辛伐他汀原料藥溶于由1.5ml乙酸乙酯及100mg PDLLA組成的溶液中，得出濃度為10％W/W的辛伐他汀工作液。將直徑1.0mm、長30mm的克氏針在辛伐他汀工作液中蘸2次，在層流環(huán)境中自然干燥后-20°保存?zhèn)溆谩?br>　　2、建模及分組。
　　72只雌性SD大鼠隨機分為辛伐他汀治療組及對照組。采用Christine等報道的方法建立SD大鼠脛骨開放

3、截骨模型，治療組用載藥的克氏針作髓內(nèi)固定物，對照組的固定物則僅含PDLLA涂層。
　　3、影像學檢查
　　于術(shù)后2周、4周及8周，戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，拍攝大鼠右脛骨側(cè)位X線片影，并按照改良Lane-Sandhu X射線評分標準對拍攝所得的X線片進行評分。
　　二、細胞實驗
　　1、 SD大鼠原代骨細胞的分離培養(yǎng)
　　無菌條件下將3只SD乳鼠的長骨及顱骨取出，剔除干凈骨膜及其他附著于骨骼上的軟組織，取Han

4、k's平衡鹽溶液將長骨內(nèi)骨髓組織沖出，然后通過序貫、交替的膠原酶消化及EDTA脫鈣法進行骨細胞的分離。用α-MEM培養(yǎng)基（含5％胎牛血清+5％小牛血清）培養(yǎng)原代骨細胞，至細胞長至融合狀態(tài)時進行細胞傳代。本研究使用第5-10代細胞進行實驗。
　　2、骨細胞的鑒定
　　骨細胞的鑒定要點有:(1)細胞外形特點:細胞外形呈星形或樹枝狀，形態(tài)偏圓偏短，表面有4個以上的突觸并與周圍細胞形成聯(lián)系;(2)細胞上清液中堿性磷酸酶測定值較低（與

5、成骨細胞相比較）;(3)骨鈣蛋白表達水平較高。
　　3、骨細胞凋亡模型的建立
　　采用腫瘤壞死因子-α刺激骨細胞而形成骨細胞凋亡模型。為了獲得TNF-α的最佳刺激濃度，使用流式細胞術(shù)檢測不同濃度（5、10、20、40 ng/ml）TNF-α刺激下骨細胞的總凋亡率，TNF-α作用時間為24小時。
　　結(jié)果:
　　一、動物實驗
　　1、影像學檢查及Lane-Sandhu評分
　　影像學檢查提示術(shù)后2周2組

6、實驗動物的X線片表現(xiàn)并無明顯差別，均未見明顯骨痂形成。術(shù)后4周、8周辛伐他汀治療組無論從骨痂形成量還是愈合質(zhì)量均優(yōu)于對照組。Lane-Sandhu影像學評分顯示:術(shù)后2周，實驗組動物的評分為(0.26±0.86)分，對照組為(0.35±1.00)分，統(tǒng)計結(jié)果為P＞0.05，無統(tǒng)計學差異。術(shù)后4周，實驗組動物的評分為(4.92±1.44)分，對照組為（3.58±2.06）分，統(tǒng)計結(jié)果為P＜0.05，且辛伐他汀治療組優(yōu)于對照組。術(shù)后8周，實

7、驗組動物的Lane-Sandhu評分為（7.92±2.53）分，對照組為(5.17±1.94)分，統(tǒng)計結(jié)果為P＜0.05，故2組動物在術(shù)后4周的Lane-Sandhu評分差異具有統(tǒng)計學意義，且治療組優(yōu)于對照組。
　　2、組織病理學檢查結(jié)果
　　HE染色結(jié)果顯示:術(shù)后第2周時，2組動物脛骨的骨折間隙由炎性纖維組織填充，均未見明顯纖維性骨痂形成。骨折固定術(shù)后4周，2組實驗動物骨折端均可見骨痂形成，實驗組的骨痂形成量較多，且骨痂中

8、可見大量新生血管，纖維骨痂逐漸被軟骨性骨痂取締。骨折內(nèi)固定術(shù)后8周，辛伐他汀組軟骨骨痂周邊連續(xù)不斷為新生骨小梁取代，骨小梁粗細較均勻，且骨小梁排列亦較術(shù)后4周時整齊，由此可見實驗組硬骨痂已逐漸開始塑形過程。相比之下，對照組軟骨骨痂數(shù)量相對較少，軟骨化骨進程緩慢，新生小梁狀骨排列紊亂無序。
　　番紅O-固綠染色結(jié)果顯示2組實驗動物組織的染色結(jié)果顯示，2組中均可見軟骨性骨痂，且辛伐他汀組骨折部位軟骨組織較對照組少，說明其骨折區(qū)軟骨化骨

9、進程比對照組快。
　　3、Western blotting檢測結(jié)果
　　Western blotting檢測結(jié)果顯示術(shù)后2周、4周及8周，辛伐他汀處理組實驗動物骨痂中骨硬化蛋白及RANKL的蛋白表達量均顯著比對照組低;而同一組實驗動物在不同時間期間此兩種蛋白的表達量亦存在顯著性差異，并呈遞減趨勢。
　　二、細胞實驗
　　1、 SD大鼠原代骨細胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　骨細胞分離培養(yǎng)初期，可見有少許成骨細胞及成

10、纖維細胞共同生長，經(jīng)多次消化、傳代后骨細胞逐漸純化，形成長勢良好、外形獨特的細胞系。骨細胞外形多呈星形或樹枝狀，細胞表面有多個長突觸，并與周圍細胞形成聯(lián)系，而成骨細胞多外形多為梭形、錐形或立方形，細胞表面突觸少且細。骨細胞體型較成骨細胞小，但更立體。此外，骨細胞的堿性磷酸酶活性比成骨細胞低(p＜0.01)，而骨鈣素表達水平卻顯著高于成骨細胞(p＜0.01)。
　　2、最佳TNF-α刺激濃度及辛伐他汀處理濃度
　　流式細胞術(shù)結(jié)

11、果示，骨細胞的總凋亡率隨TNF-α刺激濃度升高而相應(yīng)升高(F=71.57，P＜0.000)。根據(jù)檢測結(jié)果，本研究最終選用20ng/ml作為TNF-α的刺激濃度。MTT比色法檢測結(jié)果示骨細胞的活性隨著辛伐他汀刺激的濃度升高而下降(F=57.04，P＜0.000)，根據(jù)結(jié)果，選取10-5 mol/L作為本次實驗辛伐他汀的主要處理濃度。
　　3、 ROS檢測結(jié)果
　　骨細胞內(nèi)活性氧簇檢測結(jié)果顯示，TNF-α顯著刺激ROS的形成（P

12、＜0.01 vs對照組），而辛伐他汀預(yù)處理則可顯著抑制ROS的形成（P＜0.01 vs TNF-α處理組）。
　　結(jié)論:
　　本研究通過結(jié)合體內(nèi)、體外實驗兩部分，并從影像學、生物力學、組織病理學及分子生物學等多個角度，探討辛伐他汀在骨再生方面的生物學效應(yīng)及分子機制，著重觀察其對骨細胞的影響作用，全文結(jié)果總結(jié)如下:
　　1、局部應(yīng)用辛伐他汀可加速開放截骨模型骨折修復(fù)的進程及提高骨折愈合質(zhì)量，且這種促進效應(yīng)與其抑制骨細胞凋