下調(diào)EIF3B的表達(dá)抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡的初步研究.pdf

1、背景與研究目的:
　　惡性膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤,其侵襲性強(qiáng),復(fù)發(fā)率高,預(yù)后差。惡性膠質(zhì)瘤多發(fā)病于青壯年,給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。美國腦腫瘤注冊(cè)中心(GBTRUS)2007-2008年的研究報(bào)告中指出在美國膠質(zhì)瘤的發(fā)病率大約為16.5?10萬,近約7.5?10萬的膠質(zhì)瘤表現(xiàn)為高度惡性。雖然在過去10年中,外科手術(shù)、放射技術(shù)和化療藥物有了快速的發(fā)展,然而惡性膠質(zhì)瘤的治療療效仍未盡如人意,其中期生存時(shí)間約12-1

2、4個(gè)月,5年生存率不足10％。新近研究提示,靶向基因治療可能抑制膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為,改善患者預(yù)后,為膠質(zhì)瘤的防治帶來新的希望,但膠質(zhì)瘤基因治療的靶點(diǎn)仍有待進(jìn)一步探討。
　　當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成時(shí),真核翻譯起始因子(EIFs)和蛋氨酸-信使核糖核酸(Met-tRNA)一起,把80S核糖體聚集到mRNA上形成翻譯起始復(fù)合物,推進(jìn)蛋白的合成。EIF3在大分子EIFs因子中是關(guān)鍵的分子之一,其由13個(gè)亞基(EIF3A到EIF3M)組成,總計(jì)7

3、00Kda,在細(xì)胞及病毒的翻譯起始中起著至關(guān)重要的作用。目前,大量的研究已證實(shí),EIF3在哺乳動(dòng)物和酵母菌的蛋白翻譯過程的調(diào)控中仍然也起著關(guān)鍵的作用。此外,EIF3還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化參與細(xì)胞周期的調(diào)控。EIF3同時(shí)也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后也有著密切的關(guān)系。事實(shí)上,近期的研究證實(shí),在肺癌、胃癌、食管癌、宮頸癌以及結(jié)腸癌中均存在EIF3亞基表達(dá)的上調(diào)。
　　在EIF3的亞基中,EIF3B被認(rèn)為是主要的起著腳手架作用的亞基,

4、與EIF3A、EIF3G、EIF3I和EIF3J間有互相作用。人類EIF3B是一個(gè)帶RNA識(shí)別序列(RRM;位于N終站)的814-氨基酸蛋白質(zhì),RRM結(jié)構(gòu)域可以提供一個(gè)特定的位點(diǎn)與EIF3J等相互影響。目前,大量的研究提示:EIF3B同樣也參與了蛋白翻譯和細(xì)胞周期的調(diào)控以及腫瘤的發(fā)展。雖然我們對(duì)EIF3B的晶體結(jié)構(gòu)以及其極微少的功能有所認(rèn)識(shí),但EIF3B是否在膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著作用尚未有相關(guān)的深入報(bào)道。因此,目前這一研究主要是闡述

5、EIF3B在膠質(zhì)瘤致病機(jī)制中的作用。
　　材料及方法:
　　共收集10例來自于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院的惡性膠質(zhì)瘤病人的新鮮標(biāo)本以及U87、U251、SGC44、A172、U373五個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(購自ATCC)用于研究,在這10例惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本中:有2例I級(jí)膠質(zhì)瘤、2例II級(jí)膠質(zhì)瘤、3例III級(jí)膠質(zhì)瘤、3例IV級(jí)膠質(zhì)瘤。運(yùn)用Real-timePCR和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)這十個(gè)處于不同病理狀態(tài)的惡性膠質(zhì)瘤患者的組織標(biāo)本以及五個(gè)膠

6、質(zhì)瘤細(xì)胞系中EIF3BmRNA的表達(dá)。運(yùn)用慢病毒介導(dǎo)靶基因沉默技術(shù)下調(diào)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EIF3B的表達(dá)來觀察其在膠質(zhì)瘤中的作用。BrdU細(xì)胞增殖ELISA法用于分析沉默EIF3B的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA合成。下調(diào)EIF3B基因后的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期以及凋亡用FACS掃描流式細(xì)胞分析儀分析。
　　結(jié)果和討論:
　　1.利用Real-timePCR檢測(cè)方法,對(duì)十個(gè)處于不同病理狀態(tài)的惡性膠質(zhì)瘤患者的組織標(biāo)

7、本進(jìn)行EIF3BmRNA表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn):標(biāo)本中EIF3B的表達(dá)在I、II或III級(jí)中并不存在顯著的不同。有趣的是,在一個(gè)IV級(jí)的標(biāo)本中EIF3B表達(dá)顯著高于其他9個(gè)標(biāo)本。然而,更多的臨床標(biāo)本需要研究,以確定EIF3B的表達(dá)是否與惡性膠質(zhì)瘤組織的病理分級(jí)之間有相關(guān)性。
　　2.運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)五種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中EIF3B的表達(dá)進(jìn)行分析。我們發(fā)現(xiàn)U87、U251、A172和U373細(xì)胞具有較高的EIF3BmRNA表達(dá),但SG

8、C44細(xì)胞系中卻沒有EIF3BmRNA的表達(dá)。
　　3.下調(diào)EIF3B的表達(dá)能明顯的抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),BrdU細(xì)胞增殖ELISA法發(fā)現(xiàn)這種抑制和EIF3B在DNA的合成中起著重要的作用相關(guān)。
　　4.流式分析結(jié)果表明:EIF3B表達(dá)下調(diào)顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例,降低了S期細(xì)胞比例。這個(gè)結(jié)果提示:EIF3B表達(dá)下調(diào)可能通過誘導(dǎo)G0/G1期阻滯而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　5.流式分析結(jié)果表明:下調(diào)EIF3B促進(jìn)了U

9、87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡,這提示EIF3B可能參與維持U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞存活。
　　結(jié)論:
　　1.人惡性膠質(zhì)瘤(I到IV級(jí))和人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U251,U87,A172,U373)均有不同程度EIF3B的表達(dá)。
　　2.慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)顯著下調(diào)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EIF3B的表達(dá),抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。
　　3.下調(diào)EIF3B的表達(dá)誘導(dǎo)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯,這可能與其能抑制細(xì)胞