雌激素通過上調(diào)microRNA-17~92a并抑制其靶向蛋白Bim抗成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、背景:雌激素對于成骨細(xì)胞的抗凋亡作用在雌激素保護(hù)成人骨量流失的機(jī)理研究中具有極為重要的作用，但其抗成骨細(xì)胞凋亡的機(jī)理目前尚沒有明確的研究結(jié)果。近期的研究結(jié)果顯示microRNA在雌激素介導(dǎo)的一系列細(xì)胞反應(yīng)過程中都具有重要的作用，包括細(xì)胞的凋亡及分化。因此我們認(rèn)為在雌激素抗成骨細(xì)胞凋亡的過程中，microRNA也可能參與其中。
　　目的:1.驗(yàn)證雌激素在體內(nèi)和體外對成骨細(xì)胞的抗凋亡作用。2.驗(yàn)證microRNA參與了雌激素的抗成骨細(xì)

2、胞凋亡作用。3.通過尋找micro-RNA與細(xì)胞凋亡相關(guān)的目標(biāo)蛋白，分析雌激素對目標(biāo)蛋白的調(diào)控作用。
　　方法:1.選用新生C-57小鼠顱蓋骨提取成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀方法觀察成骨細(xì)胞在促凋亡因子作用下的凋亡情況以及合并雌激素干擾下的凋亡情況;使用試劑盒對促凋亡因子、雌激素干預(yù)的成骨細(xì)胞及促凋亡因子、雌激素干預(yù)的出生7天小鼠顱蓋骨進(jìn)行caspase-3活力測定;應(yīng)用western-blot技術(shù)測定促凋亡因子及雌激素干預(yù)的

3、出生7天小鼠顱蓋骨bcl-2/bax比值。
　　2.對不同干預(yù)組Dicer表達(dá)的測定及抑制Dicer表達(dá)后細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析;利用基因芯片技術(shù)測定促凋亡因子及合并雌激素干預(yù)的成骨細(xì)胞中所有microRNA，篩選有意義的表達(dá)變化，并用qRT-PCR技術(shù)加以驗(yàn)證;通過體外合成Amo-miRNA，轉(zhuǎn)染后清除micro-RNA的表達(dá)，測定各種干預(yù)情況下細(xì)胞的凋亡情況。
　　3.通過數(shù)據(jù)庫搜索micro-RNA與細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶基因

4、，測定不同干預(yù)組中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況;分析雌激素對Dicer、micro-RNA及目標(biāo)蛋白的調(diào)控;建立卵巢切除小鼠模型，分析內(nèi)源性雌激素對Dicer、micro-RNA及目標(biāo)蛋白的調(diào)控。
　　結(jié)果:1.在體外Dex、Etopside和TNF-a干預(yù)下，增加了成骨細(xì)胞的凋亡并使caspase-3活性出現(xiàn)上調(diào)，而雌激素可以明顯地降低成骨細(xì)胞的凋亡，使caspase-3活性下調(diào);在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Dex增強(qiáng)了caspase-3活性，使Bcl

5、-2/Bax值下降，而雌激素使caspase-3活性減弱，使Bcl-2/Bax值上升。
　　2.在體外Dex、Etopside和TNF-a干預(yù)下，DicermRNA表達(dá)下降，而雌激素可使其表達(dá)上升，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中Dex使DicermRNA表達(dá)下降，雌激素可以恢復(fù)其表達(dá);在體外合成siRNA，轉(zhuǎn)入細(xì)胞清除DicermRNA表達(dá)，成骨細(xì)胞凋亡增加，并可增強(qiáng)促凋亡因子的作用，而雌激素可對抗這種作用;通過基因芯片技術(shù)預(yù)測micro-RNA-1

6、7～92a與雌激素抗成骨細(xì)胞凋亡作用有關(guān)，并通過qRT-PCR獲得了驗(yàn)證;在體外合成Amo-miRNA-17～92a后，轉(zhuǎn)入細(xì)胞發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞凋亡增加，caspase-3活性上調(diào)，這種作用和促凋亡因子相協(xié)同，而雌激素可減弱這種作用。
　　3.通過TargetScan預(yù)測出micro-RNA-17～92a的目標(biāo)蛋白為與凋亡相關(guān)蛋白Bim;Bim的表達(dá)量在促凋亡因子干預(yù)下上升，而雌激素可降低它的表達(dá)，micro-RNA-17～92a的過