去泛素化酶抑制劑b-AP15通過上調(diào)Noxa誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的機制研究.pdf

1、去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）是通過水解底物蛋白泛素鏈之間的鏈接，對蛋白降解進(jìn)行反向調(diào)節(jié)，從而影響或者調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、分化、增殖等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，去泛素化酶表達(dá)異?；蚬δ芨淖兣c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。b-AP15是一種新型的抑制蛋白酶體19S調(diào)節(jié)亞基相關(guān)去泛素化酶活性的小分子抑制劑，在多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌以及急性髓細(xì)胞樣白血病模型中顯示出良好的抗腫瘤活性。有研究表明b-AP15的靶向底物UCH37在食管癌組織

2、中高表達(dá)，并與食管癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著正相關(guān)，提示b-AP15可能成為靶向治療食管癌的候選藥物。但是b-AP15在食管癌中的抗腫瘤效果及殺傷腫瘤細(xì)胞的分子機制目前尚未有研究。
　　因此通過體外實驗明確b-AP15對食管癌細(xì)胞的增殖抑制效果，闡明b-AP15在食管癌中可能的抗腫瘤分子機制，為食管癌的診斷和治療提供新的思路與理論基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.通過CCK-8、平板克隆形成實驗和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察檢測

3、b-AP15對食管鱗癌細(xì)胞EC1和Kyse450增殖的抑制作用。
　　2.通過PI染色流式細(xì)胞術(shù)測定不同濃度的b-AP15（0.4μM、0.6μM、0.8μM）處理食管鱗癌細(xì)胞EC1和Kyse450后，對細(xì)胞周期和凋亡的影響，同時用Western blot的方法檢測b-AP15作用后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白的變化。
　　3.使用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）測定不同濃度的b-AP15（0.4μM、0.6μ

4、M、0.8μM）處理對兩種腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的影響,用FITC-DEVD-FMK探針法檢測總凋亡蛋白酶caspase3的激活情況，Western blot檢測c-PARP和c-caspase3的表達(dá)，以DMSO為對照。
　　4.用流式細(xì)胞術(shù)檢測基因沉默Noxa后對b-AP15引起的細(xì)胞凋亡率的影響，確定Noxa的作用。
　　5.用Q-PCR的方法測定b-AP15作用后促凋亡相關(guān)蛋白Noxa的mRNA水平變化，Western

5、 blot檢測Myc的表達(dá)情況，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測調(diào)節(jié)Noxa基因表達(dá)的上游調(diào)控分子Myc后對b-AP15引起的細(xì)胞凋亡率的影響。用免疫印跡（Western Blot）的方法檢測沉默 Myc（Noxa的上游調(diào)控分子）后Noxa蛋白的變化。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8法、形態(tài)學(xué)觀察以及平板克隆實驗的結(jié)果顯示，b-AP15對兩種食管癌細(xì)胞都有明顯的增殖抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　2.細(xì)胞周期結(jié)果顯示，b-AP15

6、處理后EC1和Kyse450細(xì)胞阻滯在G2/M期。同時用Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)G2/M期相關(guān)蛋白p21、p27和pWee1增加，而G1期標(biāo)志性蛋白cyclinA,cyclinD沒有明顯變化，同時促凋亡蛋白Noxa明顯增加，其他促凋亡蛋白家族和抑凋亡蛋白家族的蛋白表達(dá)無明顯改變改變。
　　3.AnnexinV-FITC/PI雙染法及caspase3活性檢測評估細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明b-AP15誘發(fā)細(xì)胞

7、發(fā)生明顯的凋亡，總凋亡率，包括早期和晚期凋亡率，隨藥物濃度增高而上升。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)b-AP15處理引起凋亡標(biāo)志性蛋白，如c-PARP和c-caspase3的表達(dá)增加，呈劑量依賴性。JC-1染色流式分析發(fā)現(xiàn)b-AP15處理導(dǎo)致線粒體膜電位下降。以上這些結(jié)果提示b-AP15促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡，并且線粒體源性凋亡通路在其中發(fā)揮一定的作用。
　　4.Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)b-AP15處理細(xì)胞后促凋亡相關(guān)蛋白Noxa的m

8、RNA表達(dá)水平明顯升高，與Western blot檢測結(jié)果一致。
　　5.RNA干擾沉默Noxa或Myc，細(xì)胞的凋亡率均有所下降。Western Blot結(jié)果顯示b-AP15處理后Myc的表達(dá)水平增加，RNA干擾沉默Myc后Noxa的表達(dá)水平下降。這些結(jié)果提示Noxa很可能是b-AP15引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵作用分子。
　　結(jié)論：
　　1.在食管癌細(xì)胞EC1和Kyse450中，b-AP15通過阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制