去泛素化酶抑制劑P5091引起食管鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、蛋白質(zhì)去泛素化是指由去泛素化酶(deubiquitinases，DUBs)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素化的負(fù)向調(diào)節(jié)過程。泛素和去泛素化調(diào)節(jié)的動態(tài)平衡,影響或者調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、等許多細(xì)胞生理病理過程。去泛素化酶通過水解底物蛋白質(zhì)上的泛素鏈調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性，其活性直接影響細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的周轉(zhuǎn)率、活性、再生以及定位。P5091屬于泛素特異性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease7,USP7)的噻吩類抑制劑，能高度

2、特異性抑制 USP7酶的活性，并且在多發(fā)性骨髓瘤的治療中顯示良好的抗腫瘤效果，對萬珂、多柔比星等耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞也具有抑制作用。此外， P5091抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。然而，P5091在食管鱗癌中的作用及分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　本文主要通過體外實驗來研究P5091在食管鱗癌中作用及機(jī)制，評價P5091對食管鱗癌增殖、凋亡、克隆形成等的作用，進(jìn)一步利用 siRNA技術(shù)沉默靶基因的表達(dá)來反向驗證P5091對食

3、管鱗癌細(xì)胞的作用，闡明P5091在食管鱗癌細(xì)胞中作用的具體分子機(jī)制，為食管鱗癌治療的新藥開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為今后P5091應(yīng)用于臨床食管鱗癌的治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1. USP7在食管鱗癌中的表達(dá)水平檢測：取多株食管鱗癌細(xì)胞系和食管癌組織芯片進(jìn)行USP7蛋白水平的檢測，選取有代表性的細(xì)胞系為本實驗所用細(xì)胞系：KYSE450、KYSE510、KYSE30。
　　2.藥物濃度篩選：通過 ATP依賴的熒光素酶細(xì)

4、胞活性檢測來計算在不同細(xì)胞系中P5091的IC50值，從而確定不同細(xì)胞系的實驗藥物濃度。
　　3.平板克隆形成實驗和細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖片分析：評價不同濃度的P5091對食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖抑制效應(yīng)。
　　4.細(xì)胞凋亡檢測：用AnnexinV-FITC和 PI染色檢測不同濃度的P5091對食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30凋亡的影響。
　　5. Caspasae-

5、3的激活情況：用FITC-DEVD-FMK染色法檢測Caspase-3激活情況；Western Blot檢測P5091作用后食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的c-PARP和c-caspase-3的表達(dá)情況。
　　6.P5091對抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的影響：Western Blot檢測P5091作用后食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30中抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的變化，本實驗中Noxa發(fā)生

6、明顯變化。
　　7. P5091對Noxa mRNA水平的影響：用Q-PCR的實驗方法測定P5091處理食管鱗癌細(xì)胞后不同時間點促凋亡蛋白Noxa的mRNA水平變化。
　　8. Noxa在P5091誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用：對Noxa基因沉默后通過流式細(xì)胞術(shù)來檢測不同濃度P5091引起的食管鱗癌細(xì)胞凋亡率的變化。
　　9.轉(zhuǎn)錄因子4（Activating transcription factor4，ATF4）上調(diào)Noxa：

7、同時對Noxa和調(diào)節(jié)Noxa基因表達(dá)的上游調(diào)控分子ATF4進(jìn)行基因沉默，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度P5091引起的細(xì)胞凋亡率的變化。用Western blot的方法檢測對Noxa、 ATF4基因沉默后凋亡標(biāo)志性蛋白c-PARP蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1. P5091抑制食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖ATPlite實驗、平板克隆以及形態(tài)學(xué)觀察的實驗結(jié)果顯示，P5091可以明顯抑制食管鱗

8、癌細(xì)胞增殖，并且呈濃度依賴性。
　　2. P5091誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE510和KYSE30發(fā)生凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明不同濃度 P5091引起食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，總凋亡率隨藥物濃度增加而升高。同時Western blot實驗結(jié)果表明：細(xì)胞凋亡標(biāo)志性蛋白c-PARP和c-caspas3的表達(dá)增加，并且隨著藥物濃度增加而增高。3. P5091通過促進(jìn)促凋亡蛋白Noxa的表達(dá)來誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡

9、>　　Western Blot結(jié)果顯示，P5091處理后Noxa蛋白水平明顯增高。Q-PCR結(jié)果顯示： P5091處理后在不同的時間點食管鱗癌細(xì)胞中Noxa的mRNA水平均有明顯升高。對食管鱗癌細(xì)胞進(jìn)行Noxa基因沉默后，不同濃度P5091引起食管鱗癌細(xì)胞的總凋亡率與Noxa基因敲除前相比明顯降低，且c-PARP蛋白水平也明顯降低，提示Noxa可能是P5091作用的關(guān)鍵分子。
　　4. P5091誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（E

10、RS）
　　Western blot結(jié)果顯示P5091處理后ERS的標(biāo)志性蛋白p-EIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平明顯增高，提示P5091誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生ERS。
　　5. P5091通過上調(diào)ATF4，進(jìn)而引起Noxa積聚，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
　　Western blot結(jié)果顯示P5091處理后ATF4和Noxa蛋白水平明顯升高，且流式結(jié)果提示P5091誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時，Q-PCR結(jié)果提示P5091也上調(diào)了N

11、oxa的mRNA水平。為了進(jìn)一步探究Noxa是否是受ATF4調(diào)控，我們進(jìn)行Noxa和ATF4的基因沉默實驗。結(jié)果提示：RNA干擾沉默ATF4后，P5091引起的細(xì)胞凋亡率明顯降低，c-PARP和Noxa蛋白水平明顯降低，提示ATF4很可能是P5091引起食管鱗癌細(xì)胞凋亡中Noxa積聚的主要調(diào)節(jié)因子。
　　結(jié)論：
　　1. P5091顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖。
　　2. P5091通過ERS上調(diào)ATF4的表達(dá)，促進(jìn)No