香加皮寶霍甙-Ⅰ通過抑制β-catenin-survivin-caspase3-7通路活性誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡研究.pdf

1、目的:研究中藥香加皮提取物寶霍甙-Ⅰ體外對食管癌細(xì)胞株Eca-109增殖活性和凋亡的影響,以及β-catenin-survivin-caspase3/7通路在寶霍甙-Ⅰ誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡過程中的作用,為中藥香加皮的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1采用MTT法分析不同濃度寶霍甙-Ⅰ作用不同時間后,對Eca-109細(xì)胞增殖活性的影響,選擇最適藥物濃度和作用時間進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　 2經(jīng)AO/EB染色,應(yīng)

2、用熒光顯微鏡觀察不同濃度(Oμg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)寶霍甙-Ⅰ處理Eca-109細(xì)胞48h后,細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 3不同濃度(Oμg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)寶霍甙-Ⅰ作用于Eca-109細(xì)胞48h,經(jīng)PI單染后用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 410-40μg/ml寶霍甙-Ⅰ處理Eca-109細(xì)胞24h后,用

3、RT-PCR法檢測Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3β、CK1和Axin mRNA和天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶caspase3、caspase7 mRNA表達(dá)的影響。
　　 5 Western—Blot法檢測用不同濃度(10ug/ml、20μg/ml、40μg/ml)寶霍甙-Ⅰ作用于Eca-109細(xì)胞24h后,對β-catenin和磷酸化β-catenin、survivin蛋白表達(dá)的影響。
　　

4、6比色法檢測寶霍甙-Ⅰ作用于Eca-109細(xì)胞后,caspase3/7活性的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1 MTT檢測結(jié)果顯示,經(jīng)10—40μg/ml寶霍甙-Ⅰ作用48h后,能明顯抑制Eca-109細(xì)胞的增殖活性,與培基對照組相比有顯著性差異(P<0.01),并呈濃度及時間依賴性。而5μg/ml的寶霍甙-Ⅰ對Eca-109細(xì)胞增殖活性未見明顯影響(P>0.05)。
　　 2經(jīng)AO/EB染色和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)

5、10-40μg/ml寶霍甙-Ⅰ作用48h后,Eca-109細(xì)胞細(xì)胞染色增強(qiáng),熒光明亮,20、40μg/ml處理組細(xì)胞出現(xiàn)橙黃色熒光,對照組細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的綠色熒光。
　　 3流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,10-40μg/ml寶霍甙-Ⅰ作用48h后,Eca-109細(xì)胞凋亡比例均增加,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
　　 410-40μg/ml寶霍甙-Ⅰ處理24h后,Eca-109細(xì)胞GSK-3β、AxinmRNA表達(dá)增

6、加,β-catenin mRNA表達(dá)下降(P<0.01),均呈濃度依賴性。
　　 510-40μg/ml寶霍甙-Ⅰ作用24h后,Eca-109細(xì)胞磷酸化β-catenin蛋白表達(dá)水平升高,β-catenin和survivin蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.01)。
　　 610—40μg/ml寶霍甙-Ⅰ作用24h后,Eca-109細(xì)胞caspase3、7 mRNA表達(dá)未發(fā)生變化,caspase3/7活性升高(P<0.01)。