金安粉誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡作用及對(duì)survivin通路的影響.pdf

1、肺癌為當(dāng)今世界大多數(shù)國(guó)家發(fā)病率居第一位的惡性腫瘤，從20世紀(jì)中葉開(kāi)始其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升，目前治療效果差，化療藥物療效不理想，且毒副作用大，延長(zhǎng)肺癌患者的生存期，提高患者的生存質(zhì)量，已成為防治肺癌的最主要目標(biāo)和難題。近年來(lái)對(duì)于中藥單體的研究表明：多數(shù)中藥單體單獨(dú)抑瘤作用并不如化療藥顯著，但國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究已表明，中藥復(fù)方多種成分混合作用于人體對(duì)于穩(wěn)定瘤灶，消除亞臨床病灶，提高術(shù)后中位生存期有顯著的作用。選用有確切活性成分和療效顯著的

2、中藥復(fù)方進(jìn)行研究，能夠展現(xiàn)中醫(yī)藥防治重大疾病的巨大作用，從而為醫(yī)學(xué)界所關(guān)注。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子，也是當(dāng)前腫瘤凋亡研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)個(gè)別學(xué)者已開(kāi)始了中藥對(duì)該靶點(diǎn)的影響，但系統(tǒng)研究還未開(kāi)展；金安粉是一種由四種單體組成的混合物，主要含苦參堿、氧化苦參堿、黃芪多糖、川芎嗪等成分，其配比是在臨床對(duì)于肺癌術(shù)后患者防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移行之有效的中藥配方的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)前期動(dòng)物體內(nèi)正交實(shí)驗(yàn)得到抑瘤最佳組分配伍比例。前期藥效學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)

3、現(xiàn)該藥的抑瘤作用明顯，可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖有明顯影響，并有較好的抗Lewis肺癌移植瘤肺轉(zhuǎn)移的作用。前期毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明其具有穩(wěn)定、安全，無(wú)明顯骨髓抑制作用，前期的單體組分體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明：金安粉的活性成分均具有直接或間接的抑瘤效果。前期探討金安粉對(duì)C57BL/6J小鼠Lewis肺癌的抑制效應(yīng)及其作用機(jī)制的結(jié)果表明：金安粉各劑量組的抑瘤率依次為45-79﹪、40-90﹪、32-48﹪，流式細(xì)胞

4、儀檢測(cè)金安粉誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡率分別為24-19﹪、14-95﹪和13-93﹪，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)金安誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡率與劑量之間存在依賴(lài)關(guān)系。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，金安粉具有抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)作用；促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是金安粉治療Lewis肺癌的主要作用方式。前期體內(nèi)體外的藥物篩選實(shí)驗(yàn)證明，在體外培養(yǎng)PG.PAa肺癌細(xì)胞，金安粉可顯著抑制兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)，在熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及透射電鏡下均可見(jiàn)典型的凋亡形態(tài)改

5、變，結(jié)果表明：金安粉抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)可能是通過(guò)改變細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)旨在開(kāi)展金安粉誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的研究及對(duì)于Survivin基因的所在的凋亡通路的影響，來(lái)探討中藥復(fù)方誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制，分三部分進(jìn)行。 第一部分金安粉對(duì)肺癌細(xì)胞株的抑制作用 目的：研究金安粉對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和H446的抑制作用，篩選出對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和H446敏感的藥物濃度，同時(shí)觀察中藥同化療藥物合用的作用效果。

6、 方法：本研究通過(guò)MTS試驗(yàn)，研究不同濃度金安粉、各組成藥物單體、VP-16、PDD，及金安粉配合PDD、金安粉配合VP-16在不同的時(shí)間對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和H446的抑制作用，計(jì)算藥物對(duì)不同細(xì)胞株的抑制率，篩選金安粉敏感作用濃度。 結(jié)果：金安粉對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和H446均有不同程度的抑制并呈現(xiàn)一定的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。金安粉200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml、350ug/ml、400ug/ml對(duì)A54

7、9細(xì)胞24小時(shí)的抑制率分別為45.3﹪、49.2﹪、55.8﹪、68.7﹪、77.2﹪;金安粉200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml、350ug/ml、400ug/ml對(duì)H446細(xì)胞24小時(shí)的抑制率分別為39.6﹪、43.8﹪、49.5﹪、62.3﹪、75.7﹪。肺癌細(xì)胞株A549作用24小時(shí)的IC50為250ug/ml。金安粉對(duì)H446肺癌細(xì)胞株24小時(shí)的IC50為300ug/ml,金安粉配合化療藥物作用效果最強(qiáng)，抑制率

8、最高可達(dá)98.5﹪。 結(jié)論：金安粉(200-400ug/ml)對(duì)肺癌細(xì)胞A549、H446具有增殖抑制作用，且比同劑量任何單一成分的作用明顯，提示各組成單味藥混合在一起具有協(xié)同抑制肺癌細(xì)胞小細(xì)胞H446和非小細(xì)胞A549增殖效應(yīng)，并且這種抑制增殖作用可作用于兩種病理類(lèi)型的肺癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明，金安粉和化療藥物有協(xié)同增效作用。 第二部分金安粉誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞株A549,H446凋亡的作用 目的：研究金安粉誘導(dǎo)A54

9、9、H446肺癌細(xì)胞株的凋亡作用，采用HE染色、激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)凋亡進(jìn)行觀察并定性定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 方法：制備細(xì)胞爬片，光鏡下觀察HE染色的A549、H446細(xì)胞用藥前后的細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的變化。流式細(xì)胞術(shù)定性定量檢測(cè)：細(xì)胞經(jīng)中藥作用后，制成單細(xì)胞懸液，PI及Annexin-V染色后上機(jī)檢測(cè)凋亡率。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)：細(xì)胞經(jīng)中藥作用后,PI及Annexin-V染色后，將標(biāo)記后的標(biāo)本置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，所

10、得圖像通過(guò)鏡載攝像系統(tǒng)自動(dòng)拍照輸入電腦保存。 結(jié)果：金安粉200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml作用A549、H446細(xì)胞，和對(duì)照組即未加藥干預(yù)的細(xì)胞組比較，1.HE染色觀察出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的一些變化，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞皺縮，染色體凝集，核碎裂，核固縮，附在核膜周邊，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)的形態(tài)學(xué)改變。2.流式細(xì)胞儀測(cè)定：200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml濃度干預(yù)24h和48h，可看到凋亡細(xì)胞群。金安粉處理的

11、A549、H446細(xì)胞作用24h時(shí)和48h后，A549細(xì)胞200ug/ml處理組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率由8.61±0.062﹪提高至15.70±0.046﹪；300ug/ml處理組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率由16.45±0.016﹪提高至22.34±0.034﹪；400ug/ml處理組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率由22.89±0.082提高至36.73±0.032。H446細(xì)胞200ug/ml處理組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率由9.89±0.035﹪提高至13

12、.58±0.015﹪；300ug/ml處理組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率由11.23±0.013﹪提高至19.46±0.053﹪；400ug/ml處理組隨時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率由23.76±0.024﹪提高至33.78±0.042﹪。金安粉不同劑量組隨著劑量增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，方差分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，金安粉對(duì)A549，H446肺癌細(xì)胞株有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用；這一作用在細(xì)胞水平可以觀察到。3.激光共聚焦掃描顯

13、微鏡觀察出現(xiàn)凋亡早、中、晚期的細(xì)胞，其中細(xì)胞凋亡早期Annexin-V高染，細(xì)胞膜呈綠色熒光，PI低染，細(xì)胞核不著色；凋亡中，晚期細(xì)胞則Annexin-V和PI均高染，細(xì)胞膜呈綠色熒光，細(xì)胞核呈紅色熒光；部分細(xì)胞的細(xì)胞核呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀或梅花狀，為典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。而對(duì)照組處理的A549、H446細(xì)胞Annexin-V和PI均低染。 結(jié)論：金安粉可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549、H446凋亡，這一作用有一定的劑量和時(shí)間依賴(lài)

14、性。 第三部分金安粉誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞株凋亡與P53、Survivin、caspase-3的表達(dá)關(guān)系 目的：研究金安粉在誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞株凋亡過(guò)程中對(duì)P53、Survivin、caspase-3mRNA和蛋白的表達(dá)影響，探討金安粉誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞株凋亡的分子機(jī)制。 方法：肺癌細(xì)胞在不同濃度的金安粉作用不同的時(shí)間后，離心收集細(xì)胞，用Trizol提取液提取細(xì)胞總RNA，采用熒光定量RT-PCR的方法，檢測(cè)P53、Survivin、

15、caspase-3mRNA的表達(dá)。金安粉作用肺癌細(xì)胞株后，用免疫組化等方法，檢測(cè)P53、Survivin和caspase-3蛋白的表達(dá)和定位。 結(jié)果：1.金安粉作用肺癌細(xì)胞株A549、H446不同時(shí)間后，可以看出金安粉對(duì)SurvivinmRNA和蛋白的表達(dá)有下調(diào)作用，并有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。2.金安粉作用A549、H446細(xì)胞株不同時(shí)間后，金安粉對(duì)P53、caspase-3mRNA和蛋白的表達(dá)有上調(diào)作用，并有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。研究

16、也發(fā)現(xiàn)A549、H446肺癌細(xì)胞野生型P53蛋白主要在胞核內(nèi)表達(dá)，金安粉使A549、H446肺癌細(xì)胞野生型P53蛋白在胞核內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，表達(dá)的強(qiáng)弱與時(shí)間與濃度呈正相關(guān)，Survivin蛋白在A549、H446肺癌細(xì)胞胞漿內(nèi)有強(qiáng)表達(dá)，加用金安粉后，表達(dá)下降，表達(dá)的強(qiáng)弱與時(shí)間與濃度呈負(fù)相關(guān)。A549、H446肺癌細(xì)胞caspase-3蛋白主要在胞漿內(nèi)表達(dá)，金安粉使A549、H446肺癌細(xì)胞caspase-3蛋白在胞漿內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，表達(dá)的強(qiáng)弱與時(shí)