HOI-02通過ROS誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯的機(jī)制研究.pdf

1、在全世界范圍內(nèi)，食管癌一直是最具致命性的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在逐年增長，每年約有22萬人死于食管癌。然而，由于食管癌的易向局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的高侵襲性以及對化療的不敏感性，食管癌的治療仍是一個(gè)棘手的問題。因此，致力于有效的化合物或藥物的研究就顯得非常必要和迫切,同時(shí)探討其作用機(jī)制也為開發(fā)新的藥物提供重要的治療策略。
　　ROS(Reactive oxygen species，活性氧族)的產(chǎn)生是非手術(shù)方法（例如：化療和放療）治療腫瘤的

2、共同特征，因?yàn)镽OS能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡。目前，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生已成為治療腫瘤的一個(gè)新手段。ROS,特別是H2O2(過氧化氫),在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中可以作為第二信使發(fā)揮作用。H2O2通過改變靶蛋白（包括蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，轉(zhuǎn)錄因子和受體酪氨酸激酶）的氧化壓力來調(diào)節(jié)蛋白的活性。這類藥物治療腫瘤的優(yōu)勢在于他殺傷細(xì)胞的高度選擇性。一般情況下，腫瘤細(xì)胞具有較高的氧化壓力，因此也具有相對較高的 ROS水平，在這種環(huán)境下，如果腫

3、瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平被誘導(dǎo)繼續(xù)升高，就會(huì)超過細(xì)胞耐受的閾值而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，有趣的是，正常細(xì)胞則受影響較小，因?yàn)檎＜?xì)胞的ROS水平相對較低，而且具有強(qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)。因此，研發(fā)有效的產(chǎn)生ROS類藥物將為腫瘤治療提供新的方法，探討其作用機(jī)制也為此類藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　在本研究中，我們自主研發(fā)合成了化合HOI-02，并發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，并且抑制食管癌細(xì)胞的增殖和錨定非依賴性生長，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，

4、HOI-02誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯并最終抑制腫瘤細(xì)胞生長。數(shù)據(jù)顯示，HOI-02處理食管癌細(xì)胞24h可以導(dǎo)致近60％的細(xì)胞凋亡以及 G2-M期阻滯，與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯相關(guān)的通路 JNK/AP-1, Bcl2/caspase3和ATM/p53-p21被激活。同時(shí)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人源性腫瘤組織異體移植模型中，HOI-02也能夠明顯的抑制腫瘤組織質(zhì)量和體積的增長。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，HOI-02具有較好的抑制食管癌細(xì)胞和

5、組織生長的能力。同時(shí)，HOI-02作為NO2基團(tuán)的化合物，和被替換為NH2基團(tuán)的化合物HOI-11相比較之后，我們發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠產(chǎn)生ROS并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯并最終抑制腫瘤細(xì)胞的生長，而HOI-11則不能對食管癌細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)。由此我們判斷NO2基團(tuán)是產(chǎn)生O2-的來源，這將為研發(fā)能夠產(chǎn)生ROS的藥物提供線索和依據(jù)。
　　第一章 HOI-02能夠抑制食管癌細(xì)胞的活性和錨定非依賴性生長
　　方法
　　1.設(shè)計(jì)

6、并合成化合物HOI-02和HOI-11；
　　2.利用MS/MS方法檢測化合物HOI-02和HOI-11的純度；
　　3.MTS法檢測HOI-02和HOI-11對食管癌細(xì)胞活性的影響；
　　4.利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測HOI-02和HOI-11對食管癌細(xì)胞錨定非依賴性生長的影響。
　　結(jié)果
　　1.設(shè)計(jì)并合成了高純度的化合物HOI-02和HOI-11
　　2. HOI-02能夠劑量依賴性的抑制食管癌

7、細(xì)胞的活性，而HOI-11對食管癌細(xì)胞影響不大
　　MTS結(jié)果顯示，HOI-02處理食管癌細(xì)胞KYSE30和 KYSE510后能夠抑制細(xì)胞活力，且呈濃度和時(shí)間梯度依賴。10μM和20μM HOI-02處理KYSE510細(xì)胞48h，吸光度光譜490nm吸光值由0.5534分別降為0.25(P<0.01)和0.093(P<0.01)，呈濃度梯度依賴。而HOI-11處理的食管癌細(xì)胞系KYSE30和 KYSE510的細(xì)胞活性狀況則受影響較

8、小。10μM和20μM HOI-11處理KYSE510細(xì)胞48h，吸光度光譜490nm吸光值由0.4114分別降為0.3972(P>0.05)和0.394(P>0.05)。
　　3. HOI-02能夠抑制食管癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長，而HOI-11對食管癌細(xì)胞影響不大
　　軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HOI-02能夠明顯的抑制食管癌細(xì)胞KYSE30， KYSE450和 KYSE510的錨定非依賴性生長。1μM HOI-02對

9、KYSE510即有明顯的抑制作用(P<0.05)，5μM HOI-02能夠抑制70%的 KYSE510細(xì)胞的生長(P<0.01)，呈濃度梯度依賴。而食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE510的錨定非依賴性生長情況則受HOI-11影響較小。10μM HOI-11對食管癌細(xì)胞克隆形成沒有明顯影響，僅僅20μM HOI-11時(shí)對細(xì)胞克隆形成有部分抑制作用。
　　第二章 HOI-02能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯
　　方法

10、>　　1.流式細(xì)胞儀檢測HOI-02對食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響；
　　2.流式細(xì)胞儀檢測HOI-11對食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響；
　　3. TUNEL法分析HOI-02對食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡的影響。
　　結(jié)果
　　1. HOI-02能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯
　　流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，相比對照組，20μM HOI-02處理食

11、管癌細(xì)胞KYSE51024h能夠誘導(dǎo)48.24%的細(xì)胞凋亡（早期和晚期凋亡分別是20.89%和27.15%， P<0.01）和40.43%的G2-M期阻滯(P<0.01)，并呈濃度梯度依賴。
　　2. HOI-11處理對食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響較小
　　流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，HOI-11處理食管癌細(xì)胞對凋亡和細(xì)胞周期阻滯影響不大。相比對照組，20μM HOI-11處理細(xì)胞KYSE51024h僅能夠誘導(dǎo)

12、4.63%的細(xì)胞凋亡和2.11%的G2-M期阻滯。
　　3. TUNEL法表明HOI-02能夠明顯誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡
　　TUNEL分析結(jié)果顯示，TUNEL綠色熒光強(qiáng)度與HOI-02濃度呈劑量相關(guān)性。相比對照組，5μM HOI-02能夠誘導(dǎo)部分細(xì)胞凋亡，TUNEL綠色熒光強(qiáng)度增加，20μM HOI-02能夠明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，TUNEL綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。
　　第三章 HOI-02能夠誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生<

13、br>　　方法
　　1.通過DCFH-DA染色，用流式細(xì)胞儀檢測HOI-02和HOI-11處理食管癌細(xì)胞KYSE510時(shí)ROS的生成情況；
　　2.在HOI-02/NADPH/FMN體系中，利用自旋捕獲劑DMPO監(jiān)測ROS信號的生成；
　　3. MTS法檢測HOI-02與不同抗氧化劑NAC，GSH, Catalase和SOD共處理時(shí)對細(xì)胞活性的影響；
　　4.流式細(xì)胞儀檢測HOI-02與抗氧化劑NAC和GSH共處

14、理時(shí)對細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯的影響。
　　結(jié)果
　　1. HOI-02能夠明顯的誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，而HOI-11不能夠明顯誘導(dǎo)ROS的生成
　　流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，20μM HOI-02處理食管癌細(xì)胞KYSE5101h,3h,6h,12h和24h,其中處理1h既有ROS的生成（44.72%），6h時(shí)達(dá)到峰值（88.05%），24h時(shí)降低為32.18%。相比較HOI-02，HOI-11對細(xì)胞影響較小。
　　2.在H

15、OI-02/NADPH/FMN體系中，能夠檢測到較強(qiáng)的自由基信號，而在HOI-11/NADPH/FMN體系中則不能
　　EPR結(jié)果顯示，在電子捕獲劑DMPO的作用下，HOI-02/NADPH/FMN體系能夠產(chǎn)生明顯的自由基信號，去除HOI-02后不能夠產(chǎn)生自由基信號。同時(shí)如果在此體系中增加上GSH或者Catalase,就發(fā)現(xiàn)自由基信號消失或減弱。而如果在體系中增加 SOD，自由基信號基本不受影響，同時(shí) HOI-11/NADPH/F

16、MN體系也不能夠產(chǎn)生信號，說明相比較 HOI-02，HOI-11在此反應(yīng)體系中不能夠產(chǎn)生ROS。
　　3.抗氧化劑NAC和GSH能夠抵消HOI-02對細(xì)胞的增長抑制作用
　　MTS結(jié)果顯示，用20μM HOI-02與抗氧化劑2.5mM NAC或者2.5mM GSH共處理食管癌細(xì)胞KYSE510時(shí)，能夠抵消HOI-02對細(xì)胞增殖的抑制，細(xì)胞的生長狀況與對照組相似。Catalase能夠部分抵消HOI-02對細(xì)胞增殖的抑制，而SO

17、D與HOI-02共處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的增殖狀況基本不受影響。
　　4.抗氧化劑NAC和GSH能夠抵消HOI-02對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的影響
　　流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，20μM HOI-02處理食管癌細(xì)胞KYSE51024h能夠引起明顯的細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯，而20μM HOI-02與2.5mM NAC或者2.5mM GSH共處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞不發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期阻滯。
　　第四章 HOI-02通過調(diào)節(jié)AP-1活性和c

18、aspase蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
　　方法
　　1. Western blotting檢測HOI-02不同時(shí)間以及不同濃度處理食管癌細(xì)胞KYSE510時(shí)對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響；
　　2. Western blotting檢測500μM H2O2處理細(xì)胞后對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響；
　　3.熒光素酶報(bào)告基因的法檢測AP-1活性的變化。
　　結(jié)果
　　1. HOI-02處理細(xì)胞使凋亡相關(guān)蛋白被

19、激活
　　Western blotting結(jié)果顯示，20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細(xì)胞后，p-c-jun, p-c-fos, p-JNK, p-P38, c-PARP,c-caspase3和Bax表達(dá)增加，同時(shí)下調(diào)Bcl2的表達(dá)。不同濃度的HOI-02處理細(xì)胞后p-c-jun和p-c-fos的表達(dá)呈濃度梯度依賴，且HOI-02與NAC或者GSH共處理細(xì)胞后p-c-jun和p-c-fos的表達(dá)消失。
　　2.5

20、00μM H2O2處理細(xì)胞后相關(guān)凋亡相關(guān)蛋白被激活
　　Western blotting結(jié)果顯示，500μM H2O2處理食管癌KYSE510細(xì)胞后，p-c-jun, p-c-fos, p-JNK和p-P38表達(dá)增加，我們發(fā)現(xiàn)與H2O2相比，HOI-02處理細(xì)胞能夠激活同樣的凋亡相關(guān)蛋白通路。
　　3.隨著HOI-02處理細(xì)胞濃度增加，轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性隨之增加，同時(shí)抗氧化劑能夠抵消AP-1活性的增加
　　熒光素酶

21、報(bào)告基因檢測顯示，相比對照組,20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄因子AP-1升高2倍多，并呈濃度梯度依賴。同時(shí)，20μM HOI-02與2.5mM NAC或者2.5mM GSH共處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)AP-1活性恢復(fù)正常。
　　第五章 HOI-02通過調(diào)節(jié)P21相關(guān)的通路誘導(dǎo)細(xì)胞G2-M期阻滯
　　方法
　　1. Western blotting檢測20μM HOI-02不同時(shí)間以及不同濃度 HOI-02

22、處理食管癌細(xì)胞KYSE510對G2-M期阻滯相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響；
　　2.分析HOI-02處理食管癌KYSE510后各種相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，建立HOI-02作用機(jī)制模型。
　　結(jié)果
　　1. HOI-02處理細(xì)胞使細(xì)胞周期G2-M期相關(guān)蛋白被激活
　　Western blotting結(jié)果顯示，20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細(xì)胞后， p-CDC2, p-ATR, p-ATM, p-H2AX, p

23、-P53和P21升高，p-CyclinB1（S147）降低，不同濃度的HOI-02處理細(xì)胞后p-CDC2, p-H2AX和P21的表達(dá)呈濃度梯度依賴，且HOI-02與NAC或者GSH共處理細(xì)胞后p-CDC2, p-H2AX和P21的表達(dá)消失。2. HOI-02作用機(jī)制分析
　　HOI-02處理食管癌KYSE510細(xì)胞后，分析相關(guān)蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡要是通過JNK/c-jun,c-fos/AP-1和BCL2/caspase3途徑

24、發(fā)生，而ATM/P53-P21通路蛋白的變化則引起了G2-M期阻滯。
　　第六章在人源性腫瘤組織異種移植模型中，HOI-02能夠抑制腫瘤生長
　　方法
　　1.通過人源性腫瘤組織異體移植模型（PDX）驗(yàn)證HOI-02對食管癌組織的生長抑制作用；
　　2.免疫組化和免疫熒光法檢測PDX模型中腫瘤組織的相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1.在PDX模型中，HOI-02能夠明顯抑制食管癌組織質(zhì)量和體積的增長

25、
　　通過觀察PDX模型中腫瘤組織的變化，我們發(fā)現(xiàn)HOI-02治療食管癌組織周后，與對照組相比，HOI-02處理腫瘤組織6周后，低劑量組（10mg/kg）即能夠明顯降低腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積（p<0.01），HOI-02高劑量組（50mg/kg）對腫瘤生長抑制更為顯著。
　　2.相關(guān)蛋白的免疫組化和免疫熒光分析
　　免疫組化結(jié)果顯示,與對照組相比，HOI-02治療后的腫瘤組織中Ki-67， p-c-jun，P21和c-ca

26、spase3的表達(dá)均增加，且呈劑量依賴性。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果表明腫瘤組織中DCFH-DA的熒光強(qiáng)度隨著HOI-02濃度的增加隨之增強(qiáng)。
　　結(jié)論
　　1. HOI-02作為一新型的自主合成的化合物能夠誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，并由此通過JNK/c-jun,c-fos/AP-1和BCL2/caspase3通路引發(fā)細(xì)胞凋亡，通過ATM/P53-P21通路引發(fā)G2-M期阻滯，同時(shí)HOI-02也能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞活性和錨定非依賴性生長。

27、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人源性組織異體移植模型中，我們也發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠明顯的抑制食管癌組織質(zhì)量和體積的增長，這為藥物的臨床篩選奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也對誘導(dǎo)ROS的藥物作用機(jī)制有了更深入的認(rèn)識。
　　2. HOI-02（含有一硝基基團(tuán)-NO2）能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS和腫瘤組織的生長抑制作用，而HOI-11（含有一氨基基團(tuán)-NH2）則對食管癌細(xì)胞和組織生長影響不大，由此推斷硝基基團(tuán)-NO2是誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS的主要原因，這為含有硝基基團(tuán)- NO2類化