DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞G2-M期阻滯差異表達(dá)基因的分離與克隆.pdf

1、研究目的:DADS(Diallyl disulfide,DADS)是從大蒜中分離出的一種脂溶性單體有機(jī)硫化合物,可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯等方式抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。DADS能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的分化和凋亡,導(dǎo)致HL-60細(xì)胞增殖周期阻滯在G2/M期。本試驗(yàn)分別用經(jīng)DADS處理、無(wú)DADS處理的人白血病HL-60細(xì)胞的mRNA做為tester、driver,構(gòu)建DADS誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞G2/M期阻滯差異表

2、達(dá)文庫(kù),試圖從中分離出與G2/M期阻滯相關(guān)基因。用RACE克隆來(lái)源于DADS誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞G2/M期阻滯差異表達(dá)文庫(kù)的新EST的3、5端未知序列,為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和功能打下基礎(chǔ)。
　　方法:分別以DADS處理的HL-60細(xì)胞和未處理的人白血病HL-60細(xì)胞的mRNA做為tester和driver,用SSH構(gòu)建DADS誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞G2/M期阻滯差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。隨機(jī)挑選正向陽(yáng)性克隆,PCR檢測(cè)插入片段

3、,將含插入片段的克隆測(cè)序。Blastn分析差異cDNA片段的同源性。
　　用RT-PCR驗(yàn)證WT-1047在有無(wú)DADS處理時(shí)人白血病HL-60細(xì)胞中表達(dá)的差異性。獲得的ESTs依據(jù)其高度保守序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增的寡聚核苷酸引物,用設(shè)計(jì)的3引物和RACE試劑盒提供的5共用引物,進(jìn)行3cDNA末端快速擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy載體中,陽(yáng)性克隆測(cè)序分析后,所得EST片段進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:構(gòu)建了DADS誘

4、導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞G2/M期阻滯差異表達(dá)cDNA文庫(kù),其中包含120個(gè)正向的陽(yáng)性克隆和100個(gè)反向的陽(yáng)性克隆。51個(gè)隨機(jī)正向陽(yáng)性克隆測(cè)序、比較同源性,發(fā)現(xiàn)7個(gè)新的EST片段,已經(jīng)在GenBank中登錄。其中WT-1047僅在DADS處理人白血病HL-60細(xì)胞中有表達(dá);采用3RACE克隆出WT-1047的3端一段序列。
　　結(jié)論:構(gòu)建了DADS誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞G2/M期阻滯差異表達(dá)cDNA文庫(kù),該文庫(kù)含有120個(gè)正向