Toll樣受體3通過內(nèi)外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、目的：Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是病原相關(guān)分子模式識(shí)別受體，與相應(yīng)配體結(jié)合后激活其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和天然免疫應(yīng)答，同時(shí)促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的活化并介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)，從而在宿主抗微生物感染中發(fā)揮重要作用。TLR3是病毒雙鏈RNA識(shí)別受體，活化后能激活NF-κB和IRF3途徑來抵抗病毒感染。此外，TLR3活化后還能誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，并破壞體內(nèi)血管屏障引起病毒擴(kuò)散，從而加速疾病的進(jìn)程。本研究的目

2、的是通過分析TLR3損傷的關(guān)鍵信號(hào)分子，嘗試抑制此關(guān)鍵分子來干預(yù)TLR3誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，為臨床選擇相關(guān)靶點(diǎn)延緩感染性疾病的進(jìn)程提供理論基礎(chǔ)。 方法：1、RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)。2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)。3、Western blot檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活化。4、PI/Annexin V染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。5、抗體中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)分子與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。6、構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1+/ΔNp63α并轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞

3、，檢測(cè)ΔNp63α對(duì)TLR3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC較高表達(dá)Toll樣受體家族中的TLR2、3、4和5，低表達(dá)TLR6和9，不表達(dá)TLR1、7、8和10。作為對(duì)照人外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)所有TLR1-10基因。利用TLR3配體dsRNA的類似物Poly I：C刺激HUVEC，結(jié)果顯示Poly I：C上調(diào)TLR3基因表達(dá)并呈劑量依賴性，F(xiàn)ACS分析結(jié)果顯示HUVEC細(xì)胞表達(dá)TLR3蛋

4、白質(zhì)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Poly I：C作用TLR3誘導(dǎo)了其下游信號(hào)分子NF-κB的活化，并劑量依賴性地上調(diào)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-β的基因表達(dá)，表明HUVEC表達(dá)功能性的TLR3受體。此外，Poly I：C處理的HUVEC細(xì)胞表現(xiàn)出與Staurosprine（一種凋亡誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)）處理后相似的形態(tài)學(xué)改變，PI/Annexin V染色顯示Poly I：C誘導(dǎo)了劑量相關(guān)的細(xì)胞凋亡；這種作用

5、由TLR3所介導(dǎo)，因?yàn)門LR3的中和抗體能顯著抑制Poly I：C所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Poly I：C處理的HUVEC同時(shí)活化了caspase8和9及其下游分子PARP，caspase和PARP抑制劑能顯著抑制Poly I：C誘導(dǎo)的凋亡，表明TLR3通過內(nèi)源性途徑（又稱線粒體途徑）和外源性途徑（又稱死亡受體途徑）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于我們同期的研究還發(fā)現(xiàn)TLR3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受p53家族成員TAp63α的調(diào)控，因此我們構(gòu)建了TAp63α的顯性