二甲雙胍通過激活AMPK通路降低同型半胱氨酸對內(nèi)皮細胞的損傷.pdf

1、目的:
　　作為血管的保護傘,血管內(nèi)皮細胞能使組織液和血液通過它完成物質(zhì)代謝,而且血管內(nèi)皮細胞也能產(chǎn)生并分泌生物活性物質(zhì)用來調(diào)節(jié)凝血與抗凝平衡及血壓等特殊功能,進而使血液流動正常和血管長期通暢。同型半胱氨酸能夠使心血管疾病的發(fā)病率升高,這跟它誘導血管內(nèi)皮細胞的損傷有關。作為一種降糖藥物,二甲雙胍被研究發(fā)現(xiàn),可以使乳腺癌與心血管疾病的發(fā)病率降低,本實驗旨在探討二甲雙胍能否降低同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細胞的損傷及其可能存在的機制。

2、>　　方法:
　　①觀察不同溶度同型半胱氨酸(Hcy)作用血管內(nèi)皮細胞后對細胞活性的影響將實驗分為正常組、Hcy組,血管內(nèi)皮細胞接種24小時后進行藥物處理。Hcy組分別用250μM、500μM、1000μM及2000μM溶度的Hcy處理細胞24小時;用CCK-8試劑盒檢測Hcy處理后的各組血管內(nèi)皮細胞活性。
　?、谟^察不同濃度二甲雙胍(Metformin)作用血管內(nèi)皮細胞后對細胞活性的影響將實驗分為正常組、Merformin

3、組,血管內(nèi)皮細胞接種24小時后進行藥物處理。Merformin組分別用250μM、500μM、1000μM及2000μM溶度的Merformin處理細胞24小時;用CCK-8試劑盒檢測Metformin處理后的各組血管內(nèi)皮細胞活性。
　?、蹣嫿?Hcy的血管內(nèi)皮細胞損傷模型探討 Merformin的干預作用及其機制將實驗分為正常組,Hcy組,Merformin組,Hcy+Merformin組。細胞接種24小時后藥物處理。Hcy組加

4、入1000μM溶度的Hcy,Merformin組加入1000μM溶度的Merformin,Hcy+Merformin組同時加入1000μM溶度的Hcy及1000μM溶度的 Merformin,然后共同作用24小時。對各組進行以下方面檢測:CCK-8檢測各組血管內(nèi)皮細胞活性,測定血管內(nèi)皮細胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)、總超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性和微量丙二醛(MDA)水平,qRT-PCR測定NADPHmR

5、NA、SODmRNA及CATmRNA的表達,Western Blot測定p-AMPKα及t-AMPKα蛋白的表達。
　　結果:
　　(1)血管內(nèi)皮細胞活性
　　①與正常組比較,各溶度Hcy組血管內(nèi)皮細胞活性低(P<0.05),且隨著Hcy濃度的增加,血管內(nèi)皮細胞活性下降。
　?、谂c正常組比較,各溶度Merformin組血管內(nèi)皮細胞活性無明顯變化(P>0.05),且內(nèi)皮細胞活性與Merformin濃度無關。

6、　?、叟c正常組比較,Hcy組細胞活性低(P<0.05),Merformin組對細胞活性無明顯影響(P>0.05),而Hcy+Merformin組較Hcy組細胞活性高(P<0.05)。
　　(2)乳酸脫氫酶(LDH)活性
　　與正常組比較,Hcy組的細胞 LDH活性高(P<0.05),Merformin組的細胞LDH活性無明顯差異(P>0.05),Hcy+Merformin組LDH活性比Hcy組低(P<0.05), Merfo

7、rmin能降低Hcy導致的LDH活性的升高。
　　(3)細胞內(nèi)總SOD活性
　　與正常組比較,Hcy組的細胞總SOD活性低(P<0.05),Merformin組的細胞總 SOD活性無明顯差異(P>0.05)。Hcy+Merformin組總 SOD活性比 Hcy組高(P<0.05),Merformin能緩和Hcy導致的總SOD活性的降低。
　　(4)丙二醛(MDA)的生成水平
　　與正常組比較,Hcy組細胞MDA的

8、生成水平高(P<0.05),Merformin組的細胞MDA的生成水平無明顯差異(P>0.05)。Hcy+Merformin組細胞MDA的生成水平生成水平比Hcy組低(P<0.05),Merformin能降低Hcy導致的細胞MDA的增加。
　　(5)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性
　　與正常組比較,Hcy組的谷胱甘肽過氧化物酶活性低(P<0.05),Merformin組的細胞谷胱甘肽過氧化物酶活性無明顯差異(P>0.

9、05)。Hcy+Merformin組谷胱甘肽過氧化物酶活性比Hcy組高(P<0.05),Merformin能緩和Hcy導致的谷胱甘肽過氧化物酶活性的降低。
　　(6)NADPHmRNA的表達量
　　與正常組比較, Hcy組的細胞 NADPHmRNA的表達量高(P<0.05), Hcy+Merformin組細胞NADPHmRNA的表達量比Hcy組低(P<0.05),Merformin能降低Hcy導致的細胞NADPHmRNA的表

10、達量的升高。
　　(7)SODmRNA的表達量
　　與正常組比較, Hcy組的細胞 SODmRNA的表達量低(P<0.05), Hcy+Merformin組細胞SODmRNA的表達量比Hcy組高(P<0.05),Merformin能緩和Hcy導致的細胞SODmRNA的表達量的降低。
　　(8)CATmRNA的表達量
　　與正常組比較, Hcy組的細胞 CATmRNA的表達量低(P<0.05), Hcy+Merfo

11、rmin組細胞CATmRNA的表達量比Hcy組高(P<0.05),Merformin能緩和Hcy導致的細胞CATmRNA的表達量的降低。
　　(9)p-AMPKα及t-AMPKα蛋白的表達量。
　　與正常組比較,各實驗組的 t-AMPKα蛋白的表達量無明顯差異(P>0.05);與正常組比較,Hcy組的p-AMPKα蛋白的表達量無明顯差異(P>0.05),Merformin組及Hcy+Merformin組的p-AMPKα蛋白的

12、表達量升高(P<0.05)。Merformin使細。胞內(nèi)p-AMPKα/t-AMPKα的比值升高,從而使AMPKα的磷酸化水平升高。
　　結論:
　　①同型半胱氨酸能使血管內(nèi)皮細胞的活性降低,且隨著同型半胱氨酸的增加,對血管內(nèi)皮細胞的活性影響越大,其影響內(nèi)皮細胞活性降低與誘導細胞內(nèi)氧自由基、MDA、LDH、NADPH等水平或活性上升,而使細胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX等活性降低有關。
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