調(diào)控SIRT1-NRF2信號通路對百草枯干預(yù)的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、目的：應(yīng)用攜帶沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator1，SIRT1)沉默基因或過表達(dá)基因的慢病毒分別轉(zhuǎn)染小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(TypeⅡ alveolarepithelium cells，AECs-Ⅱ)后，觀察百草枯(paraquat，PQ)干預(yù)后核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2-related factor-2，NRF2)蛋白表達(dá)水平及其蛋白穩(wěn)定性和去乙?；剑凹?xì)胞的氧

2、化應(yīng)激狀態(tài)和細(xì)胞凋亡情況的變化，探討SIRT1去乙?；疦RF2對PQ中毒引起的小鼠ACEs-Ⅱ肺損傷的保護(hù)作用，為百草枯中毒肺損傷的抗氧化治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　實驗一:低濃度胰酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶消化法提取小鼠AECs-Ⅱ，免疫熒光(Immunofluorescence，IF)染色法鑒定所提取細(xì)胞。構(gòu)建攜帶SIRT1基因沉默及SIRT1基因過表達(dá)的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染小鼠ACE-Ⅱ，通過綠色熒光(GreenFluore

3、scent Protein，GFP)表達(dá)量和蛋白免疫印跡(Western-blot)法檢測SIRT1的表達(dá)情況驗證慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。
　　實驗二:轉(zhuǎn)染慢病毒的小鼠AECs-Ⅱ在800μM百草枯作用24h后，Western-blot法檢測SIRT1和NRF2表達(dá)變化，IF法檢測NRF2核內(nèi)表達(dá)情況，免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)檢測NRF2乙?；降母淖兦闆r，放線菌酮(Cycloheximide，CH

4、X)檢測NRF2蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性，化學(xué)比色法檢測超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量的變化，酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，Elisa)法檢測血紅素氧合酶-1(Heme Oxygenase1，HO-1)活性變化，

5、流式細(xì)胞儀和末端標(biāo)記(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling, TUNEL)法檢測細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.免疫熒光染色鑒定證實所提取的細(xì)胞為小鼠AECs-Ⅱ。熒光顯微鏡下觀察到，在感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection，MOI)為80的轉(zhuǎn)染條件下，慢病毒對小鼠AECs-Ⅱ的轉(zhuǎn)染效率為90％以上。We

6、stern-blot法結(jié)果顯示，與Control組相比，空載體組的SIRT1蛋白表達(dá)量沒有明顯差異，統(tǒng)計學(xué)沒有意義(p＞0.05);而siRNA-Sirt1組的SIRT1蛋白表達(dá)量顯著減少，LV-Sirt1組的SIRT1蛋白表達(dá)量顯著增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2.Western-blot檢測法結(jié)果顯示:與Control組相比，PQ組、PQ+siRNA-Sirt1組SIRT1蛋白表達(dá)量明顯降低，PQ+LV-S

7、irt1組SIRT1蛋白明顯升高;與PQ組相比，PQ+siRNA-Sirt1組SIRT1蛋白表達(dá)明顯降低，但是PQ+LV-Sirt1組SIRT1蛋白表達(dá)顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3.IF結(jié)果顯示:與Control組相比，siRNA-Sirt1組AECs-Ⅱ細(xì)胞核內(nèi)NRF2蛋白表達(dá)水平明顯降低，但是LV-Sirt1組細(xì)胞核內(nèi)NRF2蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　　4.NRF2去乙?；瘷z測結(jié)果顯示:與Co

8、ntrol組相比，siRNA-Sirt1組細(xì)胞內(nèi)NRF2蛋白乙酰化水平明顯增高，而LV-Sirt1組細(xì)胞內(nèi)NRF2蛋白乙酰化水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5.NRF2穩(wěn)定性檢測結(jié)果顯示:與Control組相比，PQ組、PQ+siRNA-Sirt1組及PQ+LV-Sirt1組NRF2蛋白穩(wěn)定性明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與PQ組相比，PQ+siRNA-Sirt1組NRF2蛋白穩(wěn)定性明顯降

9、低，而PQ+LV-Sirt1組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　6.氧化應(yīng)激檢測結(jié)果顯示:與Control組相比，PQ組、PQ+siRNA-Sirt1組及PQ+LV-Sirt1組SOD、GSH、CAT含量明顯降低;與PQ組相比，PQ+siRNA-Sirt1組SOD、CAT活性及GSH含量明顯降低，而PQ+LV-Sirt1組顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。與Control組相比，PQ組、PQ+si

10、RNA-Sirt1組及PQ+LV-Sirt1組MDA含量和HO-1活性明顯升高;與PQ組相比，PQ+siRNA-Sirt1組MDA含量明顯升高，PQ+LV-Sirt1組明顯降低，但是PQ+siRNA-Sirt1組HO-1活性明顯降低，而PQ+LV-Sirt1組顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　7.流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示:與Control組相比，PQ組、PQ+siRNA-Sirt1組及PQ+LV-Sirt1組

11、AECs-Ⅱ細(xì)胞凋亡率明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與PQ組相比，PQ+siRNA-Sirt1組細(xì)胞凋亡率明顯提高，PQ+LV-Sirt1組細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　8.TUNEL法檢測結(jié)果顯示:與Control組相比，PQ組、PQ+siRNA-Sirt1組及PQ+LV-Sirt1組AECs-Ⅱ TUNEL染色陽性細(xì)胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與PQ組相比，P