γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路對BMSCs向肺泡上皮細胞分化的影響.pdf

1、目的：
　　骨髓間充質干細胞（BMSCs）來源廣、易培養(yǎng)且具有誘導其定向分化目的細胞的潛能，在BMSCs分化的過程中有許多信號通路參與并發(fā)揮重要的作用，而Notch信號通路就是其中的一條。本實驗利用骨髓間充質干細胞（BMSCs）與肺泡上皮細胞（MLE-12）進行非接觸共培養(yǎng)，在共培養(yǎng)中加入γ-分泌酶抑制劑(DAPT)觀察其對BMSCs分化過程產(chǎn)生的影響，明確γ-分泌酶抑制劑（DAPT）阻斷Notch信號通路對BMSCs誘導分化肺泡

2、上皮細胞過程中的影響。
　　方法：
　　取4周左右的小鼠脛骨及股骨，采用全骨髓貼壁細胞法進行分離、培養(yǎng)骨髓間充質干細胞，取第3代的骨髓充質干細胞采用流式細胞學技術進行鑒定。將純化后的第4代骨髓間充質干細胞與肺泡上皮細胞在Transwell體系下進行非接觸共培養(yǎng)，并在共培養(yǎng)的基礎上加入γ-分泌酶抑制劑DAPT。本實驗分為3個組：空白對照組即為低糖培養(yǎng)基單獨培養(yǎng)骨髓間充質干細胞、骨髓間充質干細胞與肺上皮細胞共培養(yǎng)誘導分化組、加入

3、DAPT20ng/ml干預骨髓間充質干細胞與肺上皮細胞共培養(yǎng)誘導分化組。處理后用光鏡觀察共培養(yǎng)后BMCSs的形態(tài)結構變化，并分別在共培養(yǎng)的第10天提取蛋白及RNA,用Western和RT-qPCR檢測Notch信號通路相關基因Notch1、HES1，Ⅱ型肺泡上皮細胞特異性表面活性蛋白（surfactant protein C，SPC）、Ι型肺泡上皮細胞標志水通道蛋白（aquaporin5，AQP5）的表達含量以此評估γ-分泌酶抑制劑DA

4、PT抑制Notch信號通路對BMSCs向肺泡上皮細胞分化的作用。
　　結果：
　　1.分離后BMSCs在光鏡下可觀察到其形態(tài)為短梭形，經(jīng)流式細胞術鑒定CD29、CD44表達陽性，CD34、CD45表達陰性，表明已成功提取到BMSCs.
　　2.在光鏡下觀察共培養(yǎng)誘導分化的BMSCs由梭形逐漸變?yōu)樗其伮肥瘶由掀ぜ毎螒B(tài)。
　　3. Notch信號通路在骨髓間充質干細胞向肺泡上皮細胞分化時被激活，和空白對照組相比，N

5、otch1蛋白表達和HES1mRNA表達升高（p<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。在BMSCs與MLE-12進行共培養(yǎng)的基礎上加入抑制劑DAPT濃度為20ng/ml后，和共培養(yǎng)組相比，Notch1蛋白和HES1mRNA的表達減少（p<0.05），差異有統(tǒng)計學意義，表明在共培養(yǎng)誘導分化的過程中γ-分泌酶抑制劑DAPT能夠阻斷Notch信號通路發(fā)揮效應。
　　4.在共培養(yǎng)組、DAPT共培養(yǎng)組中將細胞培養(yǎng)10天后，經(jīng)Western和RT-

6、qPCR可檢測到 SPC、AQP5蛋白和mRNA。和空白對照組相比，共培養(yǎng)組和DAPT共培養(yǎng)組中SPC、AQP5蛋白及其mRNA的表達升高（p<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。DAPT共培養(yǎng)組與共培養(yǎng)組相比，SPC、AQP5蛋白及其mRNA的表達減少(p<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.骨髓間充質干細胞在MLE-12誘導下可以定向分化為肺泡上皮細胞
　　2.BMSCs在MLE-12誘導定向分化肺泡上皮