肺泡上皮細(xì)胞A549炎癥模型的篩選及調(diào)補(bǔ)肺腎三法方藥對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是危害人類健康的重大疑難疾病，其病理機(jī)制復(fù)雜又相互影響，其中炎癥反應(yīng)在 COPD發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。阻抑炎癥反應(yīng)是減輕癥狀，提高COPD防治水平，延緩疾病進(jìn)展的重要手段。COPD的炎癥反應(yīng)涉及多個(gè)細(xì)胞因子、多種細(xì)胞類型以及多條信號(hào)通路，從而形成COPD炎癥分子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)COPD分子網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵細(xì)胞因子及核心信號(hào)通路的研究有助于更好地闡

2、明中醫(yī)藥治療 COPD的作用機(jī)制及特點(diǎn)。本文就觀察腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549分泌炎癥因子和信號(hào)通路核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活

3、因子（JAK/STAT)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）的激活情況，篩選并優(yōu)化COPD體外炎癥模型，研究調(diào)補(bǔ)肺腎三法（補(bǔ)肺健脾方、補(bǔ)肺益腎方、益氣滋腎方）對(duì)TNF-α誘導(dǎo)下A549細(xì)胞對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用，探討中醫(yī)藥阻抑COPD炎癥的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　目的：
　　以TNF-α、LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞篩選并優(yōu)化A549細(xì)

4、胞體外炎癥模型，觀察其分泌炎癥因子的情況以及對(duì) NF-κB、MAPK、JAK-STAT、PPAR信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（Nuclear transcription factor activator protein-1，AP-1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子-3（signal transducer and activator of transciption-3，STAT3）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（Perox

5、isome proliferator activated receptor，PPAR）活性的影響，篩選其靶通路，探討調(diào)補(bǔ)肺腎三法（補(bǔ)肺健脾方、補(bǔ)肺益腎方、益氣滋腎方）對(duì)A549細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用，為揭示調(diào)補(bǔ)肺腎三法阻抑COPD炎癥反應(yīng)的分子作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法：
　　1、篩選并優(yōu)化A549細(xì)胞體外炎癥模型
　　MTT檢測(cè) TNF-α不同濃度（5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/

6、mL）誘導(dǎo)A549細(xì)胞不同作用時(shí)間（6h、12h、24h、48h、72h）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；MTT檢測(cè)LPS不同濃度（0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL）不同作用時(shí)間（6h、12h、24h、48h、72h）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。ELISA檢測(cè)20ng/mL TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h后上清中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP

7、-9）、黏蛋白5AC（MUC5AC）等細(xì)胞因子的分泌情況；ELISA檢測(cè)1μg/mL、2μg/mL LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞6h、12h、24h、48h后上清中IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-9等細(xì)胞因子的分泌情況。凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)10ng/mL、20ng/mL TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h、48h后轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、STAT3、PPAR活化情況；EMSA檢測(cè)2μg/mL LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h

8、后轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、STAT3、PPAR活化情況。
　　2、含藥血清制備
　　普通級(jí)日本大耳白兔96只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組和益氣滋腎組。分別用生理鹽水、補(bǔ)肺健脾方、補(bǔ)肺益腎方、益氣滋腎方灌胃，于第7次灌胃后1h腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清，過(guò)濾分裝，56℃、30min滅活后，-80℃保存所得含藥血清。
　　3、觀察調(diào)補(bǔ)肺腎三法對(duì)信號(hào)通路 NF-κB的影響
　　根據(jù)以上模型篩選結(jié)果，

9、分組干預(yù)細(xì)胞：分為空白血清組、模型組、補(bǔ)肺益腎組、補(bǔ)肺健脾組、益氣滋腎組，每組血清又分為低（10％）、中（20%）、高（40%）三個(gè)濃度，取上述相同指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。之后添加信號(hào)通路 NF-κB抑制劑二硫氨基甲酸肽吡咯烷（Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）組，EMSA檢測(cè) A549中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。
　　結(jié)果：
　　1、篩選并優(yōu)化A549細(xì)胞體外炎癥模型
　　1.1、 TNF-α、

10、LPS對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　與正常對(duì)照組相比，TNF-α在誘導(dǎo) A549細(xì)胞12h后，40ng/mL組 OD值降低有顯著性差異（p<0.01）；在誘導(dǎo)24h后，TNF-α10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL組OD值降低（p<0.05）；在誘導(dǎo)48h后，TNF-α20ng/mL組OD值降低（p<0.05）。與正常對(duì)照組相比，0.25-2μg/mL LPS誘導(dǎo) A549細(xì)胞6-72h，細(xì)胞 OD值的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

11、p>0.05）。
　　1.2、 TNF-α、LPS對(duì)A549細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響
　　與正常對(duì)照組相比，20ng/mL TNF-α組細(xì)胞因子MMP-9、MMP-3、TNF-α、IL-8、MUC5AC分泌水平顯著升高（p<0.05，p<0.01）；余細(xì)胞因子 TIMP-1、TIMP-1/MMP-9、IL-10、TIMP-1、IL-4分泌水平升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　與正常對(duì)照組相比，2μg/mL LPS誘

12、導(dǎo)A549細(xì)胞12h時(shí)細(xì)胞因子IL-6和IL-8分泌增多（p<0.05）；1μg/mL、2μg/mL LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞6h MMP-9分泌減少（p<0.05），2μg/mL LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞48h時(shí)MMP-9分泌減少（p<0.05）；1μg/mL LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)TNF-α分泌減少（p<0.05）；1μg/mL、2μg/mL LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞6-48h時(shí)TIMP-1分泌顯著減少（p<0.01）。1μg/m

13、L、2μg/mL LPS誘導(dǎo) A549細(xì)胞6-48h時(shí)炎癥因子 IL-10、MUC5AC分泌水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　1.3、 TNF-α、LPS對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1、PPAR、STAT3活性的影響
　　與正常對(duì)照組相比，10ng/mL、20ng/mL TNF-α組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB活性增強(qiáng)，以20ng/mL組最為顯著（p<0.01），20ng/mL TNF-

14、α組誘導(dǎo)A549細(xì)胞48h時(shí)NF-κB活性減弱（p<0.01）。與正常對(duì)照組相比，10ng/mL、20ng/mL TNF-α組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性增強(qiáng)，以20ng/mL組最為顯著（p<0.01）。與正常對(duì)照組相比，10ng/mL、20ng/mL TNF-α誘導(dǎo) A549細(xì)胞24h、48h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子PPAR、STAT3活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。2μg/mL LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí) AP-1、PP

15、AR、STAT3活性減弱（p<0.05），NF-κB活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　2、調(diào)補(bǔ)肺腎三法對(duì)TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞炎癥模型的NF-κB信號(hào)通路的影響
　　2.1、調(diào)補(bǔ)肺腎三法不同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞 A549生長(zhǎng)的影響
　　與正常對(duì)照組相比，20%調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清（補(bǔ)肺益腎組、補(bǔ)肺健脾組、益氣滋腎組）OD值明顯升高（p<0.01，p<0.05）；與模型組相比，20%調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清組OD值明顯升

16、高（p<0.01，p<0.05），40%補(bǔ)肺健脾組OD值降低（p<0.05），余濃度含藥血清OD值變化無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　2.2、調(diào)補(bǔ)肺腎三法對(duì)A549細(xì)胞分泌IL-8、MMP-9、TNF-α的影響
　　與20%空白血清組比較，模型組、調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清（補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組）及 PDTC組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)細(xì)胞因子 IL-8、MMP-9、TNF-α分泌顯著增多（p<0.01）。與20%

17、模型組比較，益氣滋腎組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí) IL-8分泌增多（p<0.05），補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組 MMP-9分泌顯著增多（p<0.01），補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組 TNF-α分泌增多（p<0.05，p<0.01），補(bǔ)肺健脾組TNF-α分泌減少（p<0.05）。
　　與40%空白血清組比較，模型組、調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清（補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組）及PDTC組誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)IL-8分泌增多（p<0.0

18、1），模型組、補(bǔ)肺益腎組、補(bǔ)肺健脾組MMP-9分泌增多（p<0.01），模型組TNF-α分泌增多（p<0.01）。與40%模型組比較，調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清（補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組）誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)TNF-α分泌顯著減少（p<0.01）；調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清（補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組）及 PDTC組誘導(dǎo) A549細(xì)胞24h時(shí) IL-8分泌減少（p<0.05）；益氣滋腎組、PDTC組誘導(dǎo) A549細(xì)胞24h時(shí)MMP-9

19、分泌減少（p<0.05，p<0.01），補(bǔ)肺益腎、補(bǔ)肺健脾組 MMP-9分泌有減少趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　2.3、調(diào)補(bǔ)肺腎三法及抑制劑PDTC含藥血清對(duì)A549細(xì)胞NF-κB通路活性的影響
　　與空白血清組相比，40%模型組血清（20ng/mL TNF-α）誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性增強(qiáng)（p<0.05）。與模型組相比，40%調(diào)補(bǔ)肺腎三法血清（補(bǔ)肺健脾組、補(bǔ)肺益腎組、益氣滋腎組）及 PD

20、TC組誘導(dǎo) A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性減弱有顯著性差異（p<0.01）。與空白血清組相比，10%、20%模型組誘導(dǎo) A549細(xì)胞24h時(shí)轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB活性有增強(qiáng)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），且與模型組相比，10%、20%調(diào)補(bǔ)肺腎三方血清組及 PDTC組轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性減弱無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. TNF-α可使A549細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分泌 IL-8

21、、MMP-9等炎癥因子，能夠激活NF-κB、MAPK信號(hào)通路，可使用TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞作為A549細(xì)胞體外炎癥模型。
　　2.確立了優(yōu)化TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞的條件，20ng/mL TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞24h作為細(xì)胞炎癥模型是適宜的。
　　3. LPS對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，對(duì)細(xì)胞分泌 IL-6、IL-8、MMP-9等炎癥因子及NF-κB、MAPK、JAK-STAT、PPAR通路的活性的影響不顯著，LP