脂多糖誘導單核細胞炎癥模型的優(yōu)化及調(diào)補肺腎三法方藥對NF-κB、STAT3通路活性的影響.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是臨床上一種具有氣流受限特征的常見疾病，且其氣流受限具有不完全可逆性，且呈現(xiàn)進行性發(fā)展的特征[1]。炎癥反應是其重要的病理特征，因此展開對氣道炎癥反應的研究，對于闡明其發(fā)病機制尤為重要。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是細菌內(nèi)毒素的主要成分,可以刺激組織細胞，通過釋放出多種炎性物質(zhì)（包括細胞因子等），誘導炎癥反應

2、[2]。炎癥反應涉及到多種細胞和多個信號通路。其中巨噬細胞起到極為重要的作用，而各信號通路組成的分子網(wǎng)絡系統(tǒng)對于其調(diào)節(jié)起到核心作用[3]。通過阻抑這些信號通路能夠抑制COPD炎癥反應，從而起到治療的作用。本文通過研究LPS誘導人單核細胞系（THP-1細胞）分泌炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織

3、抑制因子-1（TIMP-1），及對信號通路核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB)、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導-轉(zhuǎn)錄活化因子（JAK/STAT）、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)的激活情況，優(yōu)化 LPS誘導 THP-1細

4、胞體外炎癥模型，研究調(diào)補肺腎三法（補肺健脾方、補肺益腎方、益氣滋腎方）對其 IL-8、TNF-α，MMP-9分泌情況及對轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、信號轉(zhuǎn)導-轉(zhuǎn)錄活化因子3（Signal transducers and activators of transcription3，STAT3）的活性的影響。
　　目的：
　　觀察LPS誘導THP-1細胞炎癥模型的炎癥因子及NF-κB、JAK/STAT、MAPK、PPAR信號通路中NF-κ

5、B、STAT3、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白 AP-1(Nuclear factor activatorprotein-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator activa-ted receptorγ，PPARγ)活性的變化，篩選其靶通路，研究調(diào)補肺腎三法（補肺健脾方、補肺益腎方、益氣滋腎方）對THP-1細胞NF-κB、STAT3轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用，以期為揭示調(diào)補肺腎三法方藥抑制 COPD炎癥反應的分子

6、作用機制及其特點提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.優(yōu)化LPS誘導THP-1細胞炎癥模型
　　阿爾瑪藍法測定 LPS對 THP-1細胞生長的影響，分2組。不同濃度 LPS（2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL）不同時間（6h、12h、24h、48h）對THP-1細胞生長的影響；不同濃度LPS（0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL）作

7、用48h對THP-1細胞生長的影響。通過ELISA法檢測1μg/mL、2μg/mL LPS在上述不同時間點作用后細胞上清中IL-6、IL-10、IL-8、TNF-α、MMP-9、TIMP-1等細胞因子的分泌情況，篩選出 LPS最佳濃度及最佳作用時間。凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)法檢測1μg/mL LPS作用于THP-1細胞24h后轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB、AP-1、PPARγ、STAT3）活化情況。
　　2.含藥血清的制備

8、r>　　日本大耳白兔96只，隨機分為：正常對照組、補肺益腎方組、補肺健脾方組、益氣滋腎方組，分別灌喂給予生理鹽水、補肺益腎方藥、補肺健脾方藥、益氣滋腎方藥，每日2次，于最7次給藥后1h，通過腹主動脈采血，離心分離血清，過濾分裝，56℃、30min滅活后-70℃保存?zhèn)溆谩?br>　　3.觀察調(diào)補肺腎三法方藥對轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT3表達的影響
　　根據(jù)以上模型優(yōu)化結(jié)果，分組干預細胞：空白血清組、模型組、補肺益腎組、補肺健脾組、

9、益氣滋腎組。每組血清分為20％、40%兩個濃度，ELISA法檢測細胞因子 IL-8、TNF-α、MMP-9。對于 NF-κB信號通路，添加抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）組；對于 JAK-STAT信號通路，添加抑制劑stattic組，EMSA法檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT3的活性。
　　結(jié)果：
　　1.LPS誘導THP-1細胞炎癥模型
　　1.1、 L

10、PS對THP-1細胞生長的影響
　　阿爾瑪藍法測定LPS對THP-1細胞生長的影響。10μg/mL LPS誘導6h還原率降低（p<0.05），2.5-40μg/mL各濃度LPS誘導12h、24h、48h還原率降低（p<0.05）。10μg/mL LPS在6h時及2.5-40μg/mL各濃度LPS在12h、24h、48h可使細胞質(zhì)回縮，不飽滿，細胞體積偏小，長勢較慢。0.125-2μg/mL LPS作用48h對THP-1生長的影響無

11、統(tǒng)計學意義。
　　1.2、 LPS對THP-1細胞分泌細胞因子IL-6、IL-10、IL-8、TNF-α、MMP-9、TIMP-1的影響
　　ELISA法檢測1μg/mL、2μg/mL LPS作用THP-1細胞不同時間點（6h、12h、24h、48h）對細胞因子水平的影響。對于IL-6的影響：與正常對照組比較，1μg/mL、2μg/mL LPS在各個時間點IL-6分泌增多（p<0.01）；與12h同濃度的LPS比較，1μg/

12、mL、2μg/mL LPS在24h、48h時分泌IL-6增多（p<0.01)；2μg/mL組比1μg/mL組在24h、48h時分泌IL-6減少（p<0.01）。對于IL-8的影響：與正常對照組比較，1μg/mL、2μg/mL LPS在12h時IL-8分泌減少（p<0.05），在24h、48h時IL-8分泌增多（p<0.05，p<0.01）；2μg/mL組在48h時比1μg/mL組時分泌 IL-8增多（p<0.05）。
　　對于 T

13、NF-?的影響：與正常對照組比較，1μg/mL LPS在6h、48h時 TNF-?分泌增多（p<0.01），2μg/mL LPS在6h、12h、48h時TNF-?分泌增多（p<0.01）；2μg/mL組比1μg/mL組在6h、12h、48h時分泌TNF-?增多（p<0.01）。對于IL-10的影響：與正常對照組比較，1μg/mL LPS在6h時IL-10分泌增多（p<0.05），在24h IL-10分泌減少（p<0.05），2μg/mL

14、 LPS在各個時間點對IL-10的影響無統(tǒng)計學差異；2μg/mL組比1μg/mL組在6h、24h分泌IL-10減少（p<0.05）。
　　對于MMP-9的影響：與正常對照組比較，2μg/mL LPS在6h、48h時MMP-9分泌增多（p<0.01）；2μg/mL組比1μg/mL組在6h、48h分泌MMP-9增多（p<0.01）。對于TIMP-1的影響：與正常對照組比較，1μg/mL LPS在6h、48h時TIMP-1分泌減少（p<

15、0.01），在12h時TIMP-1分泌增多（p<0.05），2μg/mL LPS在6h、12h TIMP-1分泌增多（p<0.01，p<0.05），在24h、48h TIMP-1分泌減少（p<0.01）；2μg/mL組比1μg/mL組在6h時 TIMP-1分泌增多（p<0.01），在24hTIMP-1分泌減少（p<0.01）。
　　1.3、 LPS對THP-1細胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT3、AP-1、PPARγ表達的影響

16、>　　EMSA法檢測1μg/mL LPS誘導THP-1細胞24h對轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、STAT3、AP-1、PPARγ活性的影響。與正常對照組比較，1?g/mL LPS組 NF-кB、STAT3探針結(jié)合程度增多（p<0.01）；與正常對照組比較，1?g/mL LPS組對AP-1、PPARγ探針結(jié)合程度的變化無統(tǒng)計學意義。
　　2. THP-1細胞中NF-кB、STAT3調(diào)控的調(diào)補肺腎三法含藥血清對炎癥反應機制的影響
　　2.

17、1、調(diào)補肺腎三法不同濃度含藥血清對THP-1細胞生長的影響
　　通過阿爾瑪藍法測定不同濃度含藥血清對于 THP-1細胞生長的影響。與20%空白血清組比較，20%補肺益腎組還原率明顯增高（p<0.05），20%補肺健脾組、益氣滋腎組還原率明顯增高（p<0.01）；與20%模型組比較，20%補肺健脾組、20%益氣滋腎組還原率明顯增高（p<0.01）；與40%模型組比較，40%補肺健脾組還原率明顯降低（p<0.05），余濃度含藥血清還原

18、率無明顯統(tǒng)計學意義。
　　2.2、調(diào)補肺腎三法含藥血清對 THP-1細胞分泌IL-8、TNF-?、MMP-9的影響
　　ELISA法檢測調(diào)補肺腎三法（補肺健脾方、補肺益腎方、益氣滋腎方）20%及40%含藥血清對 THP-1細胞分泌 IL-8、TNF-?、MMP-9的影響。與20%空白血清組比較，20%模型組 MMP-9、TNF-?分泌增多（p<0.01，p<0.05），20%100mmol/L stattic組MMP-9、I

19、L-8的分泌減少（p<0.01），20%100mmol/L PD TC組 IL-8分泌減少（p<0.01）；與20%模型組比較，20%100mmol/L stattic組MMP-9、IL-8、TNF-?分泌減少（p<0.01），20%100mmol/L PDTC組IL-8分泌減少（p<0.01）。20%調(diào)補肺腎三法方藥對MMP-9、TNF-?的分泌有減少的趨勢，但沒有明顯的統(tǒng)計學差異。
　　與40%空白血清組比較，40%模型組MM

20、P-9、IL-8、TNF-?分泌增多（p<0.01），40%益氣滋腎組TNF-?分泌減少（p<0.01），40%100mmol/L stattic組、40%100m mol/L PDTC組MMP-9、IL-8分泌減少（p<0.01），TNF-?的分泌減少（p<0.05）；與40%模型組比較，40%含藥血清（補肺健脾、補肺益腎、益氣滋腎）MMP-9分泌減少（p<0.05），IL-8、TNF-?的分泌減少（p<0.01），100mmol/L

21、 stattic組、100mmol/L PDTC組MMP-9、IL-8分泌減少（p<0.01)，TNF-?的分泌減少（p<0.05）。
　　2.3、調(diào)補肺腎三法含藥血清藥及抑制劑對 THP-1細胞 NF-кB、STAT3轉(zhuǎn)錄因子活性的影響
　　EMSA法檢測調(diào)補肺腎三法方藥及抑制劑，20%、40%濃度含藥血清各組對NF-кB、STAT3活性的影響。對于轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的活性：與40%空白血清組比較，40%模型組與NF-кB

22、探針結(jié)合程度增多（p<0.01）；與40%模型組比較，40%調(diào)補肺腎三法（補肺健脾方、補肺益腎方、益氣滋腎方）及抑制劑 PDTC組與 NF-кB探針結(jié)合程度減少（p<0.01）；與20%空白血清組比較，20%調(diào)補肺腎三法含藥血清與NF-кB探針結(jié)合程度有增多的趨勢，但無明顯統(tǒng)計學意義；與20%模型組比較，亦無明顯統(tǒng)計學意義。
　　對于轉(zhuǎn)錄因子STAT3的活性：與40%空白血清組比較，40%模型組與STAT3探針結(jié)合程度增多（p<0

23、.01）；與40%模型組比較，40%調(diào)補肺腎三法含藥血清組及抑制劑stattic組與STAT3探針結(jié)合程度減少（p<0.01）；與20%空白血清組比較，20%模型組與 STAT3探針結(jié)合程度有增多的趨勢，但無明顯統(tǒng)計學意義；與20%模型組比較，20%調(diào)補肺腎三法含藥血清組及抑制劑stattic組無明顯統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1.1、μg/mL LPS作用THP-1細胞24h能激活NF-кB、JAK-STAT通路的活性。