γ-分泌酶抑制劑對(duì)順鉑耐藥上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、目的:上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）為最常見的卵巢惡性腫瘤，不易早期診斷，復(fù)發(fā)及死亡率高。卵巢癌目前標(biāo)準(zhǔn)治療方法主要為腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及以鉑類為基礎(chǔ)的化療，但約70-80％的患者最終會(huì)出現(xiàn)化療耐藥，引起腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，為卵巢癌治療失敗及患者死亡的重要原因，故其5年生存率一直徘徊在30％左右。因此，探討化療耐藥腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，為EOC患者延長(zhǎng)生存期和改善預(yù)后的迫切需求。

2、
　　近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)不僅參與胚胎發(fā)育及創(chuàng)傷修復(fù)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。EMT是指特定的生理或病理情況下，上皮細(xì)胞丟失上皮表型的特性轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞過(guò)程。發(fā)生EMT的細(xì)胞極性丟失，細(xì)胞間粘附力下降，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)延伸，抗凋亡能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。EMT與多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路相關(guān)。EMT過(guò)程伴隨

3、著Notch、Wnt、Hedgehog等多種信號(hào)通路的活化;轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug等表達(dá)上調(diào);上皮表型標(biāo)志物E-cadherin等表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin等表達(dá)上調(diào)。此外，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞可獲得自我更新等干細(xì)胞樣特性，這可能與腫瘤細(xì)胞發(fā)生化療抵抗相關(guān)。
　　多年研究表明，Notch信號(hào)通路在多種實(shí)體腫瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中均異常表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。新近研究表明，Notch信號(hào)通路活化可誘導(dǎo)多種腫

4、瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。γ-分泌酶為激活Notch信號(hào)通路的核心環(huán)節(jié)，而成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3及其順鉑耐藥株SKOV3/DDP，檢測(cè)其Notch1 mRNA表達(dá)量的差異，并進(jìn)一步研究γ分泌酶抑制劑DAPT作用于SKOV3/DDP細(xì)胞后，E-cadherin及vimentin的表達(dá)情況，以及其遷移及穿膜能力的改變。旨在從分子水平探討DAPT能否通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路

5、，從而抑制化療耐藥EOC的侵襲轉(zhuǎn)移能力，為化療耐藥EOC的治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，飽和濕度5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3、及其順鉑耐藥株SKOV3/DDP。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　1.倒置顯微鏡觀察SKOV3細(xì)胞及SKOV3/DDP細(xì)胞的形態(tài)并拍照。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(PT-PC)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞及

6、SKOV3/DDP細(xì)胞Notch1 mRNA表達(dá)水平。
　　3.四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法:對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞以不同濃度的DAPT(25，50，75μmol/L)作用不同時(shí)間(24h、48h、72h)，以加入DAPT的溶劑0.375％ DMSO為對(duì)照組。MTT法檢測(cè)DAPT對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，篩選出藥物作用的最適濃度及時(shí)間。
　　4.蛋白印跡法(Westem blotting):檢測(cè)SKOV3細(xì)胞及不同濃度的DAPT(0

7、，25，50，75μmol/L)作用于SKOV3/DDP細(xì)胞48h后，上皮標(biāo)記物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)記物vimentin的表達(dá)水平。
　　5.劃痕實(shí)驗(yàn):常規(guī)培養(yǎng)SKOV3/DDP細(xì)胞使其融合形成單細(xì)胞層，無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24h后，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同干預(yù)（實(shí)驗(yàn)組:50μmol/LDAPT;對(duì)照組:0.25％DMSO），在培養(yǎng)板底部中央呈“一”字形劃痕，分別于給藥后0h、24h后倒置顯微鏡(40×)下觀察照相，計(jì)算24h內(nèi)劃

8、痕愈合的面積評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。
　　6.Transwell實(shí)驗(yàn):以50μmol/L DAPT作用SKOV3/DDP細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以加入0.25％DMSO為對(duì)照組，連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后取出Transwell侵襲小室，用95％乙醇固定，經(jīng)結(jié)晶紫染色，在顯微鏡(200×)下拍照并計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　7.應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.SKOV3細(xì)胞與SK

9、OV3/DDP細(xì)胞:倒置顯微鏡下觀察，SKOV3細(xì)胞呈橢圓形、圓形或立方形，呈鋪路石樣排列，胞間連接緊密，為典型上皮樣細(xì)胞形態(tài);SKOV3/DDP細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞排列較松散，胞間連接不緊密，呈間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài);Western blotting檢測(cè)結(jié)果示:SKOV3/DDP細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)量低于SKOV3細(xì)胞（0.054±0.012 VS0.718±0.125），而Vimentin表達(dá)量高于SKOV3細(xì)胞（3.232±0.2

10、67 VS0.517±0.059），差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;RT-PCR結(jié)果示SKOV3/DDP細(xì)胞Notch1 mRNA的表達(dá)量為SKOV3細(xì)胞的3.952倍。
　　2.MTT結(jié)果示，隨著DAPT濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，SKOV3/DPP細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　3.Western blotting結(jié)果示不同濃度的DAPT（25、50、75μmol/L）作用于SKO

11、V3/DDP細(xì)胞48h后，其上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)較對(duì)照組明顯增加（0.207±0.020、0.295±0.011、0.429±0.024 VS0.054±0.012）(P＜0.01)，且隨DAPT作用濃度增加而升高，各組間差異顯著(P＜0.01);間質(zhì)標(biāo)記物vimentin表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(2.502±0.170、1.873±0.177、1.624±0.057VS3.232±0.266)(P＜0.01)，但50μmol

12、/L與75μmol/L濃度組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.以濃度為50μmol/L的DAPT作用于SKOV3/DDP細(xì)胞24h后，劃痕試驗(yàn)結(jié)果:處理組的劃痕愈合面積顯著小于對(duì)照組（14.31±3.59 VS52.91±10.59）(P＜0.01);Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果示處理組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯少于對(duì)照組（遷移實(shí)驗(yàn)13±2 VS37±2，侵襲實(shí)驗(yàn)9±1 VS27±3），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。