γ-分泌酶抑制劑DAPT急性期干預Notch信號通路對新生大鼠缺血性腦損傷的作用和機制研究.pdf

1、新生兒缺血性腦損傷是由各種原因造成的新生兒局灶或廣泛性腦血流中斷，腦組織發(fā)生缺血缺氧性改變而出現(xiàn)相應的神經(jīng)功能障礙。包括多種可以引起腦動/靜脈血栓形成或栓塞的原發(fā)病因如窒息、先天性心臟病、全身性感染、休克、血液高凝狀態(tài)、嚴重失血/貧血等。近年來的臨床資料表明新生兒期缺血性腦損傷的發(fā)病率被低估并有上升趨勢，造成遠期嚴重的神經(jīng)功能缺陷。治療的核心內(nèi)容是最大程度地保留和恢復受損區(qū)域神經(jīng)細胞的數(shù)量及功能，涉及細胞凋亡/死亡、內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖

2、/分化、定植整合和血供等多個環(huán)節(jié)，受眾多細胞信號通路介導并協(xié)調(diào)控制。目前已知的主要信號通路包括:死亡受體通路、蛋白激酶途徑、Toll樣受體和清道夫受體CD36信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶通路（PI3K-Akt/ERK）和核因子κB通路等。
　　Notch信號通路在生物學進化上相當保守，通過細胞膜上配體-受體結(jié)合釋放胞內(nèi)活性片段，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的方式激活下游靶基因，實現(xiàn)相鄰細胞之間的信號傳遞。對于神經(jīng)系統(tǒng)的重要意義在于調(diào)控胚胎期的神經(jīng)

3、發(fā)育。但Notch受體及配體同樣廣泛表達于出生后至成年期的腦組織中，參與調(diào)節(jié)不同成熟階段神經(jīng)細胞的遷移和分化、形態(tài)可塑性、突觸可塑性和細胞命運。因此有理由推測Notch信號通路和腦缺血損傷后的細胞應答修復機制密切相關。成年期缺血性腦卒中的研究已經(jīng)證實缺血可誘導Notch信號通路發(fā)生變化、并同時產(chǎn)生加重損傷和促進神經(jīng)再生的多種異質(zhì)性作用。這充分說明激活的Notch信號通路在缺血后發(fā)揮的影響有著細胞種類特異性、成熟度依賴性和受具體損傷條件限

4、制的特點。新生兒期的腦缺血損傷具有獨特的發(fā)病因素和預后，處于不同發(fā)育階段、分布于不同腦區(qū)的各類神經(jīng)構(gòu)成細胞對于缺血打擊的耐受和反應不完全一致，與發(fā)育成熟的大腦存在顯著差異;且目前對于Notch信號通路在新生兒缺血性腦損傷中作用尚無確切的資料，亟待進一步的研究，或許有助于發(fā)現(xiàn)新的干預治療靶點。
　　本研究旨在建立新生大鼠缺血性腦損傷模型，考察不同腦缺血情況下Notch信號通路變化特點;并采用γ-分泌酶抑制劑DAPT(N-[N-(3，

5、5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-Butyl Ester）在缺血急性期干預Notch信號通路的經(jīng)典活化途徑，驗證藥理學方法抑制缺血后該信號通路有效性;在此基礎上，研究DAPT對缺血損傷后腦組修復的影響以及相關的細胞現(xiàn)象和分子機制。從細胞凋亡、神經(jīng)發(fā)生、新生細胞分化、血管發(fā)生以及基因表達調(diào)控神經(jīng)發(fā)生等多角度說明Notch信號通路在未成熟期腦缺血性損傷中的作用，為今后有效防治

6、新生兒缺血性腦卒中提供一定的實驗依據(jù)。
　　目的:
　　建立新生大鼠腦缺血損傷模型，明確缺血損傷區(qū)域（缺血半影區(qū)）Notch信號通路表達變化特點，以及急性期應用γ-分泌酶抑制劑DAPT是否能有效抑制腦組織內(nèi)該通路活化水平;評價采用該藥理學手段干預腦內(nèi)Notch信號通路對缺血腦組織的保護作用及預后的影響;從神經(jīng)細胞凋亡、神經(jīng)發(fā)生、遷移分化、血管發(fā)生等方面進一步分析Notch信號通路在缺血損傷后發(fā)揮作用的可能途徑，以及涉及的相關

7、神經(jīng)發(fā)生基因表達情況。
　　方法:
　　1.動物模型和藥物干預:出生后10天的Sprague-Dawley大鼠(P10)分別采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈建立持續(xù)性全腦低灌注缺血模型（Hypoperfusion）和線栓法短暫阻斷單側(cè)大腦中動脈建立暫時性局灶性腦缺血模型(Transient focalischemia)。兩種模型均進一步分為缺血組和DAPT干預組，DAPT干預組在缺血1小時后腹腔注射DAPT（100mg/kg）一次

8、，缺血組則在缺血1小時后腹腔注射等量生理鹽水。對照組動物接受假手術而不作動脈結(jié)扎或阻斷處理。缺血術后分各時間點（術后1天、2天、5天、7天、14天、21天、28天）測定各組大鼠體重、評估一般情況;術后第4周時，采用轉(zhuǎn)棒試驗評估大鼠腦缺血后遠期的運動協(xié)調(diào)功能。并于術后第5天取各組部分實驗對象腦組織進行Western blot檢測，比較Notch信號通路關鍵分子NICD、Hes1、Hes5的表達水平變化。
　　2.DAPT干預對腦缺血

9、損傷后短期存活率、梗死范圍和遠期運動功能的影響:以缺血術后第5天為時間點，統(tǒng)計不同組別的存活率，比較DAPT干預對短期生存的影響;取缺血后24小時的暫時性局灶性腦缺血模型腦標本，三苯基氯化四氮唑(TTC)染色顯示梗死灶，作梗死灶大小的定量分析和比較;在缺血后第4周采用轉(zhuǎn)棒實驗評估DAPT干預對缺血后遠期運動功能的影響。
　　3.DAPT干預機制的分析:在不同測定時間點采集各組大鼠的腦組織標本，液氮速凍后80℃低溫冷凍保存或4％多聚

10、甲醛固定做冰凍切片。缺血后24小時為觀察時間點，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL法）檢測缺血半影區(qū)的細胞凋亡。采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)連續(xù)腹腔注射(缺血術后1小時、24小時和48小時各一次，每次50mg/kg)后，于缺血后第5天取腦切片，免疫組化方法研究不同腦區(qū)細胞增殖水平;并采用免疫熒光雙重標記的方法考察增殖細胞的分化特點和類型。取缺血后第14天的腦標本切片作缺血半影區(qū)血管基底膜標志物免疫熒光染

11、色，半定量分析血管發(fā)生的水平。采用表達譜基因芯片技術檢測缺血后第5天時暫時性局灶性腦缺血模型半影區(qū)組織中與神經(jīng)發(fā)生及干細胞分化有關的基因mRNA表達水平，并用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應技術(qRT-PCR)進行驗證。
　　結(jié)果:
　　1.P10 SD大鼠采用雙側(cè)勁動脈永久結(jié)扎和線栓法短暫阻斷大腦中動脈兩種方法分別模仿持續(xù)性全腦低灌注缺血和暫時性局灶性腦缺血可以建立新生兒期缺血性腦損傷的動物模型。缺血手術后的大鼠表現(xiàn)為活力減退

12、、體重下降，以術后1周內(nèi)最為明顯。缺血后第4周時缺血組大鼠的運動功能受到損傷。
　　2.缺血引起腦組織內(nèi)Notch信號通路激活。缺血后第5天時兩種不同缺血模型NICD、Hes1和Hes5的蛋白表達水平均較對照組顯著提高（分別為P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001）;采用急性期DAPT干預可以有效抑制該通路在缺血后的活化（P＜0.001，和缺血組相比較），NICD的水平甚至低于對照組的基礎水平（Hypoperfusion模型

13、24.31±5.73％，F(xiàn)ocal ischemia模型37.44±2.93％，P＜0.001）。
　　3.DAPT急性期干預提高了缺血后模型動物的短期存活比率。缺血后第5天時，DAPT干預組的存活率明顯高于缺血組(Hypoperfusion模型:77.8％∶33.3％;Focal ischemia模型:72.7％∶33.3％,P＜0.05)。
　　4.在暫時性局灶性腦缺血模型上,急性期DAPT干預使得缺血后24小時的梗死灶

14、范圍較缺血組下降了22.26％(P＜0.001)。
　　5.急性期DAPT干預明顯改善兩種不同缺血模型缺血后第4周時大鼠的運動功能（和缺血組相比較，P＜0.05）。
　　6.急性期DAPT干預在兩種不同缺血模型上均能減少缺血后24小時的缺血半影區(qū)細胞凋亡的發(fā)生（P＜0.001）。
　　7.缺血發(fā)生后第5天，兩種不同缺血模型的梗死灶周邊移行區(qū)增殖細胞數(shù)量明顯高于對照組（P＜0.05），DAPT干預進一步提高這種新生細胞的

15、聚集現(xiàn)象（P＜0.05，和缺血組相比）。與之相反的，側(cè)腦室下區(qū)的增殖細胞密度受到缺血的抑制（P＜0.05，和對照組相比），DAPT則能逆轉(zhuǎn)這一趨勢（P＜0.05，和缺血組相比）。
　　8.在暫時性局灶性腦缺血模型的缺血半影區(qū)內(nèi)，DAPT提高了缺血后第5天時Nestin+/BrdU+共定位細胞比例，同時降低了Iba1+/BrdU+共定位細胞比例（P＜0.05，和缺血組比較）。
　　9.DAPT干預提高了缺血后14天時暫時性局灶

16、性腦缺血模型半影區(qū)的血管密度（P＜0.05，和缺血組比較）。
　　10.在暫時性局灶性腦缺血模型上，基因芯片檢測結(jié)果顯示缺血和DAPT兩種因素都會引起和神經(jīng)發(fā)生、干細胞分化相關的基因表達水平變化。DAPT干預誘導了7種新的基因表達（對照組和缺血組均陰性），顯著上調(diào)了其他2種基因的表達（對照組陽性，和缺血組相比變化倍數(shù)＞1.5）;同時重新沉默了4種基因的表達（對照組陰性而缺血組陽性），并顯著下調(diào)了其他11種基因的表達（對照組陽性，和

17、缺血組相比變化倍數(shù)＞1.5）。表達水平上調(diào)和被誘導的基因產(chǎn)物主要和細胞增殖、突觸功能、細胞黏附、轉(zhuǎn)錄因子以及G-蛋白耦聯(lián)受體信號通路有關，而表達下調(diào)的基因則與G-蛋白耦聯(lián)受體信號通路、細胞周期阻滯、細胞遷移/黏附、轉(zhuǎn)錄/生長因子等細胞動能有關。qRT-PCR檢測對7種組間變化倍數(shù)＞1.5倍的基因mRNA進行擴增和定量分析，所得到的變化趨勢和在基因芯片上觀察到的相一致。
　　結(jié)論:
　　1.新生未成熟腦發(fā)生缺血性損傷可以激活N

18、otch信號通路。采用γ-分泌酶抑制劑DAPT急性期干預可以有效抑制該通路的活化水平。
　　2.DAPT急性期抑制Notch信號通路提高新生兒期未成熟腦缺血性損傷后的短期存活率，縮小局灶性缺血模型的梗死范圍，并改善遠期的運動功能。
　　3.新生兒期未成熟腦缺血后DAPT抑制Notch信號通路所產(chǎn)生的神經(jīng)保護作用與抑制細胞凋亡、誘導細胞增殖、調(diào)控分化、促進增殖細胞在受損區(qū)域聚集及血管發(fā)生有關。
　　4.缺血后DAPT急性