調(diào)控Wnt信號(hào)通路對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞在急性呼吸窘迫綜合征小鼠體內(nèi)向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化和肺損傷修復(fù)作用的影響研究.pdf

1、研究目的:證實(shí)活化Wnt經(jīng)典或非經(jīng)典Wnt5a/ROR2通路能促進(jìn)MSCs在ARDS肺組織中的存留及向肺泡Ⅱ型上皮分化，并能增強(qiáng)MSCs修復(fù)肺損傷的作用。
　　研究?jī)?nèi)容:通過(guò)構(gòu)建攜帶目的基因（β-catenin和ROR2基因）的慢病毒載體，以其轉(zhuǎn)染MSCs活化Wnt經(jīng)典或非經(jīng)典Wnt5a/ROR2通路，將轉(zhuǎn)染后的MSCs移植入LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠體內(nèi)，觀察轉(zhuǎn)染后的MSCs在肺組織中的存留，向肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分化及修復(fù)肺損傷的作

2、用。
　　第一部分慢病毒介導(dǎo)的β-catenin或ROR2基因轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的長(zhǎng)期穩(wěn)定高表達(dá)或干擾β-catenin或受體酪氨酸激酶樣孤受體（Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor2，ROR2）基因的小鼠骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(mice bore marrow derived mesenchymal stem cells，mMSCs)

3、細(xì)胞株。
　　方法:(1)采用直接貼壁法從C57BL/6小鼠原代分離mMSCs，并通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表面標(biāo)志物和誘導(dǎo)成脂、成骨、成軟骨分化以對(duì)其進(jìn)行鑒定。(2)通過(guò)Gateway clone技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)β-catenin或ROR2的慢病毒質(zhì)粒，設(shè)立只表達(dá)綠色熒光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)的空白對(duì)照質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切法構(gòu)建干擾β-catenin或ROR2的慢病毒質(zhì)粒，設(shè)立無(wú)意義序列的對(duì)照質(zhì)粒，然

4、后分別通過(guò)Lipofectamine2000與包裝質(zhì)粒pLV/helper-SL3，pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒的包裝，然后轉(zhuǎn)染mMSCs，高表達(dá)細(xì)胞株用G418進(jìn)行藥物篩選，挑取克隆純化傳代培養(yǎng)20代后，熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因GFP陽(yáng)性細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析GFP陽(yáng)性細(xì)胞比率，qRT PCR（Quantitative real-time polymerase cha

5、in reaction）法和Western blot法檢測(cè)mMSCs的β-catenin或ROR2基因和蛋白表達(dá)水平評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。(3) Western blot法檢測(cè)高表達(dá)和干擾β-catenin的mMSCs細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白水平，高表達(dá)和干擾ROR2的mMSCs與高濃度Wnt5a共孵育后檢測(cè)磷酸化JNK/總JNK和磷酸化PKC/總PKC水平，評(píng)估基因轉(zhuǎn)染后對(duì)經(jīng)典Wnt和非經(jīng)典Wnt5a/ROR2通路的調(diào)控作用。(4)體外

6、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株成骨，成脂分化，并通過(guò)qRT PCR測(cè)定成骨基因Runx2和OSX，成脂基因C/EBPα和PPAR-γ mRNA表達(dá)水平，評(píng)估基因轉(zhuǎn)染對(duì)mMSCs成骨成脂分化的作用;MTT法評(píng)估基因轉(zhuǎn)染對(duì)mMSCs增殖的作用;劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)估基因轉(zhuǎn)染對(duì)mMSCs的遷移能力的作用。
　　結(jié)果:(1)分離純化后的mMSCs為成纖維細(xì)胞樣，流式細(xì)胞學(xué)鑒定表達(dá)CD29、CD34、CD44，不表達(dá)CD117，且可

7、體外誘導(dǎo)分化為成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。(2)慢病毒介導(dǎo)的高表達(dá)或干擾β-catenin或ROR2基因轉(zhuǎn)染mMSCs，傳代培養(yǎng)20代后，轉(zhuǎn)染效率仍高達(dá)92.61％-97.04％，高表達(dá)β-catenin或ROR2基因的mMSCs的β-catenin或ROR2 mRNA和蛋白水平均顯著增加，干擾β-catenin或ROR2基因的mMSCs的β-catenin或ROR2 mRNA和蛋白水平均顯著降低。(3)高表達(dá)β-catenin基

8、因的mMSCs細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的蛋白水平明顯增加，而干擾β-catenin基因后mMSCs核內(nèi)β-catenin的蛋白水平明顯減少;與高濃度Wnt5a共孵育后高表達(dá)ROR2基因的mMSCs的磷酸化JNK/總JNK和磷酸化PKC/總PKC明顯增加，干擾ROR2基因的mMSCs的磷酸化JNK/總JNK和磷酸化PKC/總PKC明顯減少。(4)高表達(dá)β-catenin或ROR2促進(jìn)mMSCs成骨分化同時(shí)抑制成脂分化，而干擾β-cate

9、nin或ROR2抑制mMSCs成骨分化同時(shí)促進(jìn)成脂分化;高表達(dá)β-catenin或ROR2促進(jìn)mMSCs水平和垂直遷移，并促進(jìn)mMSCs增殖，而干擾β-catenin或ROR2抑制mMSCs水平和垂直遷移，并抑制mMSCs增殖。
　　結(jié)論:慢病毒載體介導(dǎo)的β-catenin或ROR2基因改造能實(shí)現(xiàn)有效而穩(wěn)定的mMSCs的Wnt信號(hào)通路的調(diào)控，并進(jìn)一步影響mMSCs在體外的成骨和成脂分化，增殖和遷移。這種在表型和功能上穩(wěn)定長(zhǎng)期改變W

10、nt信號(hào)通路的mMSCs細(xì)胞株的成功構(gòu)建有助于在體研究Wnt信號(hào)通路對(duì)mMSCs細(xì)胞功能的影響。
　　第二部分經(jīng)典Wnt通路對(duì)MSCs在ARDS小鼠體內(nèi)向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)及肺損傷修復(fù)作用的影響
　　目的:明確經(jīng)典Wnt/β-catenin通路在ARDS小鼠體內(nèi)對(duì)mMSCs向ARDS小鼠的肺組織遷移存留及向ATⅡ細(xì)胞分化的作用，以及對(duì)mMSCs修復(fù)ARDS小鼠肺損傷的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:C57BL/6小鼠隨機(jī)

11、分為NS+PBS組（正常對(duì)照組），LPS+PBS組(ARDS組)，LPS+MSC-GFP組（MSC-GFP治療組），LPS+MSC-Ctnnb1組（高表達(dá)β-catenin的MSC-Ctnnb1治療組），氣道內(nèi)滴入LPS誘導(dǎo)ARDS小鼠動(dòng)物模型，按分組經(jīng)不同處理后3d，7d，14d(1)處死小鼠留取肺組織，HE染色行組織病理學(xué)檢查和肺損傷評(píng)分評(píng)價(jià)肺損傷程度;記錄各組小鼠生存只數(shù)評(píng)價(jià)14d病死率;近紅外成像追蹤離體肺中NIR815標(biāo)記的M

12、SCs以及免疫熒光染色評(píng)價(jià)MSCs在肺組織中的存留;免疫熒光雙染色共定位及Western blot檢測(cè)肺組織中SP-C表達(dá)水平評(píng)價(jià)MSCs在肺組織中向ATⅡ細(xì)胞分化;計(jì)算肺濕重/體重比評(píng)價(jià)肺水腫程度;Western blot檢測(cè)肺組織中Occuldin表達(dá)水平評(píng)價(jià)MSCs對(duì)肺上皮細(xì)胞緊密連接的作用;Masson染色及Ashcroft評(píng)分評(píng)價(jià)肺纖維化程度。(2)或留取肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，B

13、ALF)，ELISA法檢測(cè)IL-1beta、IL-6、IL-10的濃度評(píng)價(jià)肺部炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度;ELISA法檢測(cè)總蛋白和白蛋白水平評(píng)價(jià)肺上皮通透性;ELISA法檢測(cè)角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Keratinocyte growth factor，KGF)水平評(píng)價(jià)MSCs的旁分泌對(duì)肺通透性的影響。
　　結(jié)果:(1)高表達(dá)β-catenin的MSCs與MSC-GFP比較能更顯著減輕LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺病理?yè)p傷，肺損傷評(píng)分LPS+MSC-Ct

14、nnb1組與LPS+MSC-GFP組比較[3d:(7.57±0.27) vs(9.07±0.43);7d:(5.08±0.63) vs(6.45±0.64);14d:(2.87±0.25) vs(4.07±0.29)，P＜0.05];雖然兩組14d病死率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有下降趨勢(shì)[16.7％ vs25％，P＞0.05]。(2)高表達(dá)β-catenin增加MSCs在LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺組織的存留。LPS誘導(dǎo)后3d，7d和14d進(jìn)行小

15、鼠離體肺的近紅外成像，經(jīng)過(guò)顏色編碼的熒光圖像分析發(fā)現(xiàn)LPS+MSC-Ctnnb1組小鼠離體肺圖像信號(hào)明顯高于LPS+MSC-GFP組;對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)LPS+MSC-Ctnnb1組小鼠肺組織內(nèi)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于LPS+MSC-GFP組。(3)高表達(dá)β-catenin促進(jìn)MSCs在LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺內(nèi)向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化。LPS誘導(dǎo)后14d取小鼠肺組織進(jìn)行免疫熒光雙染色，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)

16、LPS+MSC-Ctnnb1組小鼠肺組織內(nèi)GFP和SP-C雙染陽(yáng)性mMSCs細(xì)胞數(shù)量明顯高于LPS+MSC-GFP組;Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS+MSC-Ctnnb1組小鼠肺組織SP-C蛋白水平表達(dá)顯著高于LPS+MSC-GFP組[(0.66±0.11) vs(0.48±0.08)，P＜0.05]。(4)高表達(dá)β-catenin的MSCs減輕LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺炎癥反應(yīng)。LPS誘導(dǎo)后3d，高表達(dá)β-catenin的M

17、SCs與MSC-GFP比較能更降低IL-1 beta水平[(64.89±8.25) vs(90.68±14.33) pg/ml，P＜0.05]和增加IL-10水平[(214.32±18.89) vs(151.39±11.71) pg/ml，P＜0.05]從而更減輕ARDS小鼠肺炎癥反應(yīng)。(5)高表達(dá)β-catenin的MSCs改善LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺通透性。LPS+MSC-Ctnnb1組與LPS+MSC-GFP組比較:LPS誘導(dǎo)后

18、3d及14d的LWW/BW明顯降低;3d，7d及14d的BALF中TP和ALB濃度顯著降低;14d的肺組織中上皮緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)顯著增加;14d的小鼠BALF中的KGF濃度顯著增加。(6)高表達(dá)β-catenin的MSCs減輕LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺纖維化。LPS誘導(dǎo)后14d小鼠肺纖維化評(píng)分LPS+MSC-Ctnnb1組與LPS+MSC-GFP組比較[(0.67±0.12) vs(1.37±0.08)，P＜0.05]

19、。
　　結(jié)論:高表達(dá)β-catenin活化經(jīng)典Wnt/β-catenin通路，能增加mMSCs在ARDS小鼠肺組織存留，促進(jìn)mMSCs向ATⅡ細(xì)胞分化;促進(jìn)mMSCs對(duì)肺炎癥損傷修復(fù);改善肺上皮通透性及減輕肺水腫程度及增強(qiáng)mMSCs改善肺纖維化的作用，從而促進(jìn)mMSCs修復(fù)ARDS肺損傷。由此可以推測(cè)經(jīng)典Wnt/β-catenin通路對(duì)調(diào)節(jié)mMSCs在ARDS肺內(nèi)存留，分化為ATⅡ細(xì)胞和修復(fù)肺損傷發(fā)揮了重要作用。
　　第三部

20、分非經(jīng)典Wnt通路對(duì)MSCs在ARDS小鼠體內(nèi)向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)及肺損傷修復(fù)作用的影響
　　目的:明確非經(jīng)典Wnt5a/ROR2通路在ARDS小鼠體內(nèi)對(duì)mMSCs向ARDS小鼠的肺組織遷移存留及向ATⅡ細(xì)胞分化的作用，以及對(duì)mMSCs修復(fù)ARDS小鼠肺損傷的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:(1) LPS氣道內(nèi)滴入誘導(dǎo)ARDS模型，模型復(fù)制成功后立即處死小鼠取肺組織，western blot檢測(cè)Wnt5a蛋白水平，氣道內(nèi)滴入與

21、LPS等體積NS的小鼠作為正常對(duì)照組(n=4)。(2)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為NS+PBS組（正常對(duì)照組），LPS+PBS組(ARDS組)，LPS+MSC-GFP組(MSC-GFP治療組)，LPS+MSC-ROR2組（高表達(dá)ROR2的MSC-ROR2治療組），氣道內(nèi)滴入LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠動(dòng)物模型，按分組經(jīng)不同處理后3d，7d，14d處死小鼠留取肺組織，HE染色行組織病理學(xué)檢查和肺損傷評(píng)分評(píng)價(jià)肺損傷程度;記錄各組小鼠生存只數(shù)評(píng)價(jià)1

22、4d病死率;近紅外成像追蹤離體肺中NIR815標(biāo)記的MSCs以及免疫熒光染色評(píng)價(jià)MSCs在肺組織中的存留;免疫熒光雙染色共定位及Western blot檢測(cè)肺組織中SP-C表達(dá)水平評(píng)價(jià)MSCs在肺組織中向ATⅡ細(xì)胞分化;計(jì)算肺濕重/體重比評(píng)價(jià)肺水腫程度;Western blot檢測(cè)肺組織中Occuldin表達(dá)水平評(píng)價(jià)MSCs對(duì)肺上皮細(xì)胞緊密連接的作用;Masson染色及Ashcroft評(píng)分評(píng)價(jià)肺纖維化程度。(3)或留取肺泡灌洗液（Bro

23、nchoalveolar lavage fluid，BALF），ELISA法檢測(cè)IL-1beta、IL-6、IL-10的濃度評(píng)價(jià)肺部炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度;ELISA法檢測(cè)總蛋白和白蛋白水平評(píng)價(jià)肺上皮通透性;ELISA法檢測(cè)KGF水平評(píng)價(jià)MSCs的旁分泌對(duì)肺通透性的影響。
　　結(jié)果:(1)LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺組織較正常肺組織的Wnt5a水平明顯增高[(0.69±0.06) vs(0.33±0.03)，P＜0.05]。(2)高表達(dá)RO

24、R2的MSCs與MSC-GFP比較能更顯著減輕LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺病理?yè)p傷，肺損傷評(píng)分LPS+MSC-ROR2組與LPS+MSC-GFP組比較[3d:(8.83±0.23) vs(9.07±0.43);7d:(4.97±0.55) vs(6.45±0.64);14d:(3.08±0.32) vs(4.07±0.29)，P＜0.05];雖然兩組14d病死率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有下降趨勢(shì)[20.8％ vs25％，P＞0.05]。(3)高表

25、達(dá)ROR2增加MSCs在LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺組織的存留。LPS誘導(dǎo)后3d，7d和14d進(jìn)行小鼠離體肺的近紅外成像，經(jīng)過(guò)顏色編碼的熒光圖像分析發(fā)現(xiàn)LPS+MSC-ROR2組小鼠離體肺圖像信號(hào)明顯高于LPS+MSC-GFP組;對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)LPS+MSC-ROR2組小鼠肺組織內(nèi)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于LPS+MSC-GFP組。(4)高表達(dá)ROR2促進(jìn)MSCs在LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺內(nèi)向Ⅱ型肺泡

26、上皮細(xì)胞分化。LPS誘導(dǎo)后14d取小鼠肺組織進(jìn)行免疫熒光雙染色，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)LPS+MSC-ROR2組小鼠肺組織內(nèi)GFP和SP-C雙染陽(yáng)性mMSCs細(xì)胞數(shù)量明顯高于LPS+MSC-GFP組;Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS+MSC-ROR2組小鼠肺組織SP-C蛋白水平表達(dá)顯著高于LPS+MSC-GFP組[(0.70±0.11) vs(0.48±0.08)，P＜0.05]。(5)高表達(dá)ROR2的MSCs減輕LPS誘導(dǎo)的ARDS

27、小鼠肺炎癥反應(yīng)。LPS誘導(dǎo)后3d，高表達(dá)ROR2的MSCs與MSC-GFP比較能更降低IL-1 beta水平[(66.69±9.28) vs(90.68±14.33) pg/ml，P＜0.05]和增加IL-10水平[(285.94±26.30) vs(151.39±11.71) pg/ml，P＜0.05]從而更減輕ARDS小鼠肺炎癥反應(yīng)。(6)高表達(dá)ROR2的MSCs改善LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺通透性。LPS+MSC-ROR2組與LP

28、S+MSC-GFP組比較:LPS誘導(dǎo)后3d及14d的LWW/BW明顯降低;3d，7d及14d的BALF中TP和ALB濃度顯著降低;14d的肺組織中上皮緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)顯著增加;14d后小鼠BALF中的KGF濃度顯著增加。(7)高表達(dá)ROR2的MSCs減輕LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠肺纖維化。LPS誘導(dǎo)后14d小鼠肺纖維化評(píng)分LPS+MSC-ROR2組與LPS+MSC-GFP組比較[(0.85±0.15) vs(1.37±0

29、.08)，P＜0.05]。
　　結(jié)論:LPS誘導(dǎo)ARDS時(shí)肺組織高表達(dá)的非經(jīng)典Wnt5a配體通過(guò)與高表達(dá)其受體ROR2的mMSCs結(jié)合后活化非經(jīng)典Wnt5a/ROR2通路，能增加mMSCs在ARDS小鼠肺組織存留，促進(jìn)mMSCs向ATⅡ細(xì)胞分化;促進(jìn)mMSCs對(duì)肺炎癥損傷修復(fù);改善肺上皮通透性及減輕肺水腫程度及增強(qiáng)mMSCs改善肺纖維化的作用，從而促進(jìn)mMSCs修復(fù)ARDS肺損傷。由此可以推測(cè)非經(jīng)典Wnt5a/ROR2通路也對(duì)調(diào)節(jié)