過表達(dá)Derlin-1對(duì)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的：觀察過表達(dá)Derlin-1的RLE-6TN細(xì)胞經(jīng)香煙煙霧提取物（cigarette smoke extrac，CSE）不同時(shí)間處理后的凋亡率的變化。探索其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)性凋亡(Endoplasmic reticulum stress induced apoptosis,ERSIA)的關(guān)系。
　　方法：攜帶Derlin-1編碼序列的慢病毒轉(zhuǎn)染RLE-6TN細(xì)胞過表達(dá)Derlin-1基因；轉(zhuǎn)染空白慢病毒作為對(duì)照組；制備CSE;

2、用10％CSE處理對(duì)照組、過表達(dá)組細(xì)胞0h、3h、6h、12h、24h;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率；Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞Derlin-1、IRE1、p-IRE1、JNK、P-JNK,CHOP、caspase12蛋白的表達(dá);Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞Derlin-1mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.慢病毒過表達(dá)Derlin-1穩(wěn)定株的檢測(cè)：Western blot檢測(cè)過表達(dá)組Derli

3、n-1蛋白的表達(dá)較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。Realtime-PCR檢測(cè)Derlin-1mRNA的表達(dá)結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。
　　2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：用10%CSE處理對(duì)照組、過表達(dá)組細(xì)胞0h,3h,6h,12h,24h后收集細(xì)胞，用Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。對(duì)照組及過表達(dá)組凋亡率隨著處理時(shí)間延長而增加，每組各時(shí)間點(diǎn)之

4、間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。過表達(dá)組凋亡率較對(duì)照組均明顯降低，同一時(shí)間點(diǎn)的兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　3.Derlin-1在各組細(xì)胞中的表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示對(duì)照組Derlin-1的表達(dá)隨CSE處理時(shí)間的延長呈逐漸增加的趨勢(shì)，且組與組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。在過表達(dá)組，Derlin-1的表達(dá)同樣呈現(xiàn)出隨時(shí)間延長的增長趨勢(shì)，各組間的兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0

5、.05）。但每組較對(duì)照組表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。Realtime-PCR檢測(cè)兩組Derlin-1mRNA的表達(dá)結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。
　　4.Derlin-1對(duì)ERS通路的影響：Western blot結(jié)果顯示在對(duì)照組及過表達(dá)組中總的IRE1的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)的變化不大，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。兩組的p-IRE1均有隨處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，每組各時(shí)間點(diǎn)的比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義（p<0.05)。但過表達(dá)組的p-IRE1的表達(dá)量較對(duì)照組有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）
　　5.Derlin-1對(duì)ERSIA通路的影響：Western blot結(jié)果顯示在對(duì)照組和過表達(dá)組中總JNK的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。p-JNK與CHOP的表達(dá)量在兩組中均有逐漸增加的趨勢(shì)，呈時(shí)間依賴性，每組各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。兩種蛋白過表達(dá)組較對(duì)照組

7、表達(dá)量均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。caspase12的表達(dá)量在對(duì)照組從3h升高，12h達(dá)高峰，24h有所下降，但仍高于0h組，各時(shí)間點(diǎn)的兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。在過表達(dá)組中，caspase12的表達(dá)隨時(shí)間的延長而增加，但各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量較對(duì)照組均下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：CSE誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞發(fā)生ERS，促進(jìn)ERSIA的發(fā)生。Derlin-1的上調(diào)可以緩解ERS,保