香煙提取物對人肺泡Ⅱ型上皮細胞MMP-9、TIMP-1分泌的影響及意義.pdf

1、目的:研究表明，香煙煙霧中的有害毒性物質(zhì)多達上千種，是多種肺部疾病的共同危險因素。也有研究提出，吸煙可能與特發(fā)性肺纖維化(IPF)的發(fā)病有著密切的關聯(lián)，但其具體作用機制尚不完全清楚。香煙煙霧中含有多種炎癥介質(zhì)，包括氧化劑(coxidant)和朊酶類(proteases)等，最終可導致蛋白酶/抗蛋白酶失衡參與眾多肺部疾病的發(fā)病。近年，在肺間質(zhì)纖維化的形成機制中，MMPs/TIMPs（金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑）比例失衡逐漸成為研究的

2、熱點和重點。其中，MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）作為一種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，在細胞外基質(zhì)降解、肺組織結構重塑等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用，參與多種肺部疾病的發(fā)生，其活性受特異性抑制劑，即基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的調(diào)節(jié)。在各種外界刺激因素的作用下，二者比例及相互作用發(fā)生紊亂，可導致細胞外基質(zhì)降解受阻、細胞外蛋白沉積、肺組織重構等病理改變，從而參與肺間質(zhì)纖維化(pulmonary interstitial fiber

3、osis)的發(fā)病。
　　本實驗旨在通過研究香煙提取物(cigerette smoking extract，CSE)對體外培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細胞來源的人A549細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix Metalloproteinase-9，MMP-9)及其組織抑制因子(tissue inhibitorofmetal loproteinase-1，TIMP-1)的影響，探討吸煙作為一種危險因素參與肺間質(zhì)纖維化過程的可能機制。
　

4、　方法:體外培養(yǎng)人A549細胞，取指數(shù)生長期細胞用于實驗。兩支去過濾嘴香煙由經(jīng)改造的50ml注射器負壓吸引裝置連續(xù)勻速抽吸燃燒著，將煙霧經(jīng)另一出口入20ml1640培養(yǎng)基中制成懸液。15分鐘內(nèi)將2支香煙燃盡。充分搖動使其溶解，用氫氧化鈉(NAOH)將pH調(diào)至7.4左右，0.22um孔徑的濾器過濾，除去細菌和雜質(zhì)，所得溶液在30分鐘內(nèi)用于實驗。將原液配成不同濃度干預人A549細胞24小時，并依據(jù)濃度的不同將實驗分為四組:對照組、A組（2.

5、5％CSE干預組）、B（5％CSE干預組）、C(10％CSE干預組)。并分別收集C組干預A549細胞0h，3h，6h，9h，12h，48h的培養(yǎng)上清液。光學倒置電子顯微鏡分別觀察四組細胞干預24小時后的形態(tài)學變化;酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測上清液中MMP-9、TIMP-1的濃度;分別收集干預24h后各組培養(yǎng)細胞，提取細胞中的蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度，Western Blot法檢測細胞中MMP-9、TIMP-1蛋白的表達。<

6、br>　　結果:
　　1、細胞形態(tài)學變化
　　倒置顯微鏡觀察各組培養(yǎng)24小時后的細胞形態(tài)。對照組細胞表現(xiàn)為貼壁、扁平梭形生長，細胞形態(tài)規(guī)則，細胞生長旺盛。在經(jīng)過不同CSE濃度干預后的A（2.5％CSE干預組）、B（5％CSE干預組）、C(10％CSE干預組)三組細胞形態(tài)較對照組差異較大，且呈現(xiàn)出干預濃度越高，細胞生長情況越差的特點。主要表現(xiàn)為細胞數(shù)量減少、體積縮小，細胞貼壁能力下降，細胞之間空間增大。而C組細胞形態(tài)變化較對照

7、組更為顯著。大部分細胞已回縮變圓且細胞密度明顯減低，胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)明顯增多，細胞貼壁能力大大減低。
　　2、CSE干預后A549細胞分泌MMP-9的變化
　　ELISA結果顯示，對照組MMP-9含量為（1.70±0.12ng/ml），A、B、C三組濃度呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，三組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），且A、B、C三組之間相互比較差異也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。同時，觀察C組作用不同時間MMP-9的表

8、達我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著作用時間的延長，其表達呈不斷升高趨勢。0h時其濃度為（1.76±0.31 ng/ml），48h時其濃度最高達到(9.29±0.76 ng/ml)。經(jīng)過統(tǒng)計學分析可以得出結論，3h-48h各組與0h比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，9h-48h與3h比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、CSE干預后A549細胞分泌TIMP-1的變化
　　ELISA結果顯示，對照組TIMP-1含量為(2.

9、20±0.31 ng/ml)，A、B、C三組濃度呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，三組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且A、B、C三組之間相互比較也具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。同時，觀察C組作用不同時間TIMP-1的表達我們可以發(fā)現(xiàn)，隨著作用時間的延長，其表達呈不斷升高趨勢。0h時其濃度為（2.52±0.41 ng/ml），48h時其濃度最高達到（16.31±0.96ng/ml）。經(jīng)過統(tǒng)計學分析可以得出結論，3h-48h各組與0h比

10、較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，9h-48h與3h比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　4、CSE干預后A549細胞MMP-9/TIMP-1的變化
　　ELISA結果顯示在A549細胞培養(yǎng)24小時后，對照組MMP-9/TIMP-1數(shù)值為(0.77±0.05)，而在經(jīng)CSE干預后的A、B、C三組數(shù)值相比對照組均降低，三組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），但各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.

11、05）。觀察C組在干預的不同時間MMP-9/TIMP-1比值的變化發(fā)現(xiàn)，12h、24h及48h與0h比較具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而3h、6h及9h與0h比較無明顯統(tǒng)計學意義。0h、6h與3h比較差異無明顯統(tǒng)計學意義，而9h、12h、24h、48h與3h比較差異則具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　5、 CSE干預A549細胞24h后MMP-9、TIMP-1蛋白的表達
　　各組細胞干預24小時后Western Blo

12、t顯示，對照組MMP-9及TIMP-1蛋白表達較少，而A、B、C各組兩種蛋白表達均較對照組升高，且隨著干預濃度的升高蛋白表達逐漸增加。
　　結論:
　　1、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌MMP-9、TIMP-1增加。
　　2、CSE能引起肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌MMP-9、TIMP-1增加，且呈現(xiàn)出時間及濃度依賴性。
　　3、CSE能引起MMP-9/TIMP-1比例失衡，并呈現(xiàn)出先高后低的趨勢。
　　4、CS