調(diào)控PI3K-mTORC2信號(hào)通路對(duì)肺泡上皮鈉離子通道作用機(jī)制的研究.pdf

1、急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征是呼吸危重癥醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)及難點(diǎn)。其病理特征是由多種原因致肺微血管通透性增高，從而導(dǎo)致肺泡滲出富含蛋白質(zhì)的水腫液及透明膜形成。臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫、非心源性肺水腫及頑固性低氧血癥。由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，機(jī)理且尚未完全闡明，故至今仍缺乏高效的治療手段，導(dǎo)致極高的病死率。ALI/ARDS發(fā)生時(shí)，因肺泡腔內(nèi)含有過(guò)多的水腫液聚集，含水量為正常的3-4倍，從而導(dǎo)致氣體交換障礙，引起頑固性低氧血癥及肺水腫，改善肺泡液的清除

2、能力是治療該病的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)如果能有效地清除肺泡腔內(nèi)過(guò)多的水腫液，對(duì)維持氣體交換和改善患者氧合至關(guān)重要，可明顯降低ARDS患者的病死率。肺泡上皮鈉通道是肺泡腔內(nèi)鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)和推動(dòng)水腫液清除的重要環(huán)節(jié)。因此，研究調(diào)控ENaC相關(guān)的上游信號(hào)通路，找到具有高效特異性的新治療靶點(diǎn)，為改善該疾病治療新進(jìn)展、提高ALI/ARDS治療生存率提供理論依據(jù)。
　　目的：通過(guò)藥物干預(yù)PI3K/mTORC2信號(hào)通路以及構(gòu)建針對(duì)mTORC2特異組成蛋白中r

3、ictor基因的重組慢病毒沉默載體，研究mTORC2/SGK1信號(hào)通路對(duì)肺泡上皮細(xì)胞鈉離子通道（epithelial sodium channelα-subunit）表達(dá)的影響。并探討其在急性呼吸窘迫綜合征（ acute respiratory distress syndrome，ARDS）及急性肺損傷（acute lung injury，ALI）中的作用。
　　方法：
　　1.胰島素、雷帕霉素及PP242干預(yù)A549細(xì)胞系

4、，觀察PI3K/mTORC2信號(hào)通路下游rictor、SGK、ENaC-α，β，γmRNA及蛋白表達(dá)的情況。
　　2.細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀測(cè)各組藥物作用后的細(xì)胞系中SGK、ENaC-α的結(jié)合和分布情況，初步探討幾者之間的關(guān)聯(lián)。
　　3.構(gòu)建目的基因的shRNA-rictor干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照組并與慢病毒包裝體系共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒上清后進(jìn)行離心、濃縮及純化后獲取重組慢病毒。感染目的A549細(xì)胞并篩選細(xì)胞穩(wěn)定株。采用PC

5、R和western blot法檢測(cè)該研究通路中下游各信號(hào)指標(biāo)表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.相比空白組，在胰島素組中Rictor、SGK1、ENaC mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高，在PP242組中Rictor、SGK1、ENaC mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低。相比PP242組相比，雷帕霉素組中Rictor、SGK1、ENaC mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。
　　2.相比空白組，在胰島素組中SGK1、ENaC熒光結(jié)合能力明顯

6、增強(qiáng)，在PP242組中SGK1、ENaC熒光結(jié)合能力明顯下降，而雷帕霉素組無(wú)明顯改變。
　　3.成功構(gòu)建沉默rictor基因的重組慢病毒和感染A549細(xì)胞，并獲得細(xì)胞穩(wěn)定株。與空白組及陰性對(duì)照組相比，shRNA-rictor組中rictor和下游SGK1、α-ENaC mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1. ENaC受PI3K/mTORC2/SGK1信號(hào)通路的調(diào)控。
　　2.通過(guò)慢病毒載體干擾mT