淫羊藿素通過(guò)抑制脂肪酸合成酶活性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制.pdf

1、研究背景： 淫羊藿苷(icariin，ICA，一種黃酮醇糖苷)分子量為676，是箭葉淫羊藿的主要成分。淫羊藿素(icaritin，ICT)分子量為368，是ICA的3種代謝產(chǎn)物之一，也屬于黃酮類化合物。已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，黃酮類化合物，如茶葉中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、毛地黃黃酮、櫟皮黃酮、山奈酚等，均具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。雖然有關(guān)淫羊藿苷抗腫瘤活性的研究已有較多報(bào)道，但目前對(duì)淫羊藿素與腫瘤關(guān)系的研究?jī)H局限于其通過(guò)擬雌激素樣作用

2、促進(jìn)雌激素受體陽(yáng)性癌細(xì)胞增殖。 在對(duì)上述黃酮類化合物的研究中發(fā)現(xiàn)它們具有一個(gè)共同的作用靶點(diǎn)--脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)。FAS是1994年Kuhajda等[1]發(fā)現(xiàn)的一種癌基因抗原-519，是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，其終產(chǎn)物為軟脂酸(palmitic acid，PA)。后者作為組成細(xì)胞膜脂的基礎(chǔ)物質(zhì)，其含量的多寡直接影響著細(xì)胞增殖的速度。在正常情況下，F(xiàn)AS除在肝臟中高表達(dá)參與脂類物質(zhì)的合成外，

3、在其他人體組織中含量很低。腫瘤細(xì)胞FAS表達(dá)增高順應(yīng)了腫瘤細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)的特性，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖提供了原料[2]。 人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)是腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)的另一個(gè)基因。HER2為酪氨酸激酶受體，屬于erbB家族，與上皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)非常相似，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生

4、長(zhǎng)與分化[3]。HER2在多種腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)，HER2過(guò)表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，并與腫瘤患者的預(yù)后不良有關(guān)。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)[4]，F(xiàn)AS和HER2在某些癌細(xì)胞中有同時(shí)過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象。不論是對(duì)FAS進(jìn)行藥物抑制還是基因沉默都可抑制HER2表達(dá)，而HER2過(guò)表達(dá)也可使FAS表達(dá)增高，表明FAS和HER2之間具有雙向調(diào)節(jié)的機(jī)制。 本課題致力于挖掘淫羊藿素作為傳統(tǒng)中草藥活性分子單體的新的藥用價(jià)值，研究淫羊藿素抑制腫瘤細(xì)胞

5、生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及其分子機(jī)制，初步評(píng)價(jià)淫羊藿素作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用潛能。主要研究?jī)?nèi)容包括：(1)淫羊藿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制的實(shí)驗(yàn)；(2)淫羊藿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制的分子機(jī)制研究。 研究方法： 一、淫羊藿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制的實(shí)驗(yàn) 我們的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，微量淫羊藿素對(duì)雌激素受體陽(yáng)性細(xì)胞具有生長(zhǎng)刺激作用，但較高濃度的淫羊藿素可誘導(dǎo)雌激素受體陰性腫瘤細(xì)胞凋亡，而誘導(dǎo)雌激素受體陽(yáng)性腫瘤

6、細(xì)胞凋亡的敏感性則較差。在對(duì)多個(gè)細(xì)胞株篩選試驗(yàn)后，本文選擇具有代表性的雌激素受體陰性腫瘤細(xì)胞株SK-Br-3乳腺癌細(xì)胞和LnCap前列腺癌細(xì)胞(均高表達(dá)FAS和HER2)，以及MCF-10a正常乳腺細(xì)胞作為靶細(xì)胞。首先通過(guò)四氮唑藍(lán)細(xì)胞活力測(cè)定法(MTT)對(duì)經(jīng)淫羊藿素處理的SK-Br-3乳腺癌細(xì)胞、LnCap前列腺癌細(xì)胞以及MCF-10a正常乳腺細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。以濃度梯度淫羊藿素處理細(xì)胞72hr，未處理細(xì)胞作為參照，明確淫羊藿素

7、能否有效抑制SK-Br-3細(xì)胞和LnCap細(xì)胞生長(zhǎng)，以及對(duì)正常細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性作用。同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)淫羊藿素是否促進(jìn)SK-Br-3細(xì)胞凋亡，即sub-G1期細(xì)胞數(shù)量是否增加。在48hr時(shí)觀察不同濃度作用下SK-Br-3細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)淫羊藿素的細(xì)胞毒性作用。 二、淫羊藿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制的分子機(jī)制研究 本部分實(shí)驗(yàn)的主要目的是明確淫羊藿素腫瘤細(xì)胞毒性的作用靶點(diǎn)及其影響的信號(hào)通路。在以往的研究中

8、，F(xiàn)AS被認(rèn)為是黃酮類化合物抗腫瘤活性的一個(gè)靶點(diǎn)，然而將這一靶點(diǎn)與FAS/HER2信號(hào)通路聯(lián)系起來(lái)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先檢驗(yàn)外源軟脂酸對(duì)淫羊藿素的細(xì)胞毒性是否具有逆轉(zhuǎn)作用。軟脂酸作為FAS的直接產(chǎn)物，當(dāng)酶活性受到抑制時(shí)，其產(chǎn)量下降，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖。如在培養(yǎng)基中加入一定量的軟脂酸，理論上可以完全彌補(bǔ)這一缺失。在淫羊藿素給藥前，將SK-Br-3細(xì)胞與軟脂酸共同孵育，隨后加入淫羊藿素，觀察軟脂酸對(duì)淫羊藿素細(xì)胞毒性作用的影響。在隨后的淫

9、羊藿素抑制FAS活性的試驗(yàn)中，將提取于SK-Br-3細(xì)胞的蛋白提取液與半數(shù)抑制濃度的淫羊藿素孵育10min，與反應(yīng)液混合后，在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)340nm處NADPH的吸光度變化。這是一種基于NADPH消耗的酶活性測(cè)定方法，簡(jiǎn)單易行。當(dāng)FAS活性被抑制時(shí)，NADPH的利用度就會(huì)下降，測(cè)得的340nm處吸光度值高；反之則低。該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从骋蜣剿貙?duì)FAS活性的抑制程度。 為了明確淫羊藿素對(duì)FAS/HER2細(xì)胞信號(hào)通路的作用，在淫

10、羊藿素給藥后，應(yīng)用Western blot檢測(cè)SK-Br-3細(xì)胞表達(dá)HER2、多瘤增強(qiáng)子活化子3(polyoma enhanceractivator3，PEA3)蛋白的變化。PEA3是處于FAS與HER2通路之間的一個(gè)分子。當(dāng)FAS受到抑制時(shí)，PEA3表達(dá)增加，與HER2基因啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而抑制HER2表達(dá)。因此，如果淫羊藿素能夠抑制FAS活性，則PEA3表達(dá)升高，而HER2表達(dá)降低。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、淫羊藿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)

11、胞凋亡和生長(zhǎng)抑制 MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿素對(duì)SK-Br-3細(xì)胞和LnCap細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為8.6μg/mL和3.08μg/mL，而對(duì)正常乳腺細(xì)胞MCF-10a的半數(shù)抑制濃度大于20μg/mL。在藥物濃度為5μg/mL時(shí)，SKBr3細(xì)胞及LnCap細(xì)胞存活率與未加藥組之間即有顯著差異(P＜0.001)，而MCF-10a與未加藥組之間在20μg/mL才有顯著差異(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著淫羊藿素給藥

12、時(shí)間延長(zhǎng)，SK-Br-3細(xì)胞株的凋亡率逐漸提高。48hr DMSO空白對(duì)照組凋亡率為0.57±0.11％，淫羊藿素給藥36hr組凋亡率為8.12±1.13％，48hr組為49.55±1.01％，且各組之間具有顯著差別(P＜0.01)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也顯示，隨著給藥濃度增加，細(xì)胞間連接減少，細(xì)胞數(shù)量降低，細(xì)胞形態(tài)變圓，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。 以上結(jié)果表明，淫羊藿素可有效誘導(dǎo)SK-Br-3細(xì)胞和LnCap細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制，并呈濃度依賴

13、性，而正常細(xì)胞對(duì)淫羊藿素不敏感，提示淫羊藿素可以作為抗腫瘤藥物進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。 二、淫羊藿素通過(guò)抑制FAS活性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng) 外源軟脂酸逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在淫羊藿素分別為8μg/mL、5μg/mL，和2.5μg/mL時(shí)，7μg/mL軟脂酸可使腫瘤細(xì)胞存活率分別提高18.30±1.0％、21.87±0.9％和15.37±2.5％，均具有顯著差異(P＜0.05)。說(shuō)明軟脂酸對(duì)淫羊藿素的細(xì)胞毒性具有一定的逆轉(zhuǎn)作用，提示FA

14、S可能是淫羊藿素的一個(gè)作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(DMSO)相比，淫羊藿素半數(shù)抑制濃度給藥后FAS活性明顯下降。在5μg/mL、8.6μg/mL和20μg/mL給藥濃度時(shí)，與未給藥組相比，F(xiàn)AS抑制率分別為15.35％、49.26％和70.11％。因此我們認(rèn)為，淫羊藿素的腫瘤細(xì)胞毒性作用是通過(guò)其對(duì)FAS活性抑制實(shí)現(xiàn)的，即FAS是淫羊藿素的一個(gè)作用靶點(diǎn)。 三、淫羊藿素通過(guò)影響FAS-HER2通路抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

15、 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，淫羊藿素給藥組SK-Br-3細(xì)胞HER2表達(dá)下降，為未給藥組的0.63倍，而PEA3表達(dá)增高，為未給藥組的6.58倍，與淫羊藿素抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用一致。提示對(duì)FAS/HER2表達(dá)通路的影響是淫羊藿素的腫瘤細(xì)胞毒性作用的另一分子機(jī)制。 研究結(jié)論： 1.淫羊藿素能夠誘導(dǎo)雌激素受體陰性腫瘤細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制； 2.淫羊藿素的作用靶點(diǎn)為FAS，通過(guò)抑制FAS活性