Rho GTP酶在ω-3多不飽和脂肪酸抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、腫瘤是目前威脅人類健康最兇險(xiǎn)的疾病之一，而腫瘤轉(zhuǎn)移是引起癌癥病人死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制異常復(fù)雜并受多種因素影響，除了腫瘤細(xì)胞與組織器官微環(huán)境相互作用，機(jī)體整體調(diào)節(jié)作用外，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性(黏附性、侵襲性、遷移性)與腫瘤轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系。而這些生物學(xué)特性與細(xì)胞內(nèi)主要由微絲和微管構(gòu)成的細(xì)胞骨架密切相關(guān)，細(xì)胞骨架重組在腫瘤細(xì)胞偽足突起、細(xì)胞一細(xì)胞外基質(zhì)(Excracellularmatrix，ECM)黏附、黏著斑(Focal ad

2、hesion COlnplex，F(xiàn)AC)的形成、對(duì)ECM的侵襲、在血管或淋巴管中的遷移及在新的組織器官定植生長等多個(gè)轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)中起關(guān)鍵作用，而這些細(xì)胞事件主要依賴Rho GTP酶調(diào)節(jié)。Rho GTP酶屬Ras超家族，是一組相對(duì)分子質(zhì)量大約為20～25 kD的GTP結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，因此習(xí)慣被稱為Rho GTP酶，RhoA，Rac1和cdc42是目前研究最多的Rho GTP酶。Rho GTP酶是細(xì)胞骨架的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，能誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白

3、和微管蛋白分別組裝為微絲和微管，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移過程。Rho GTP酶是重要的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，在高轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞及腫瘤轉(zhuǎn)移灶組織內(nèi)表達(dá)異常升高，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，也是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，抑制Rho GTP酶的活性或阻斷其介導(dǎo)的信號(hào)通路均可有效減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。 膳食中的ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 Polyunsaturated fatty acid，ω-3 PuFA)是一

4、類具有多種生物學(xué)功能的重要營養(yǎng)素，主要包括二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acjd，DHA)，是對(duì)人體非常重要的多不飽和脂肪酸。ω-3 PUFA不僅能顯著影響多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤病人化療同時(shí)增加膳食ω-3 PUFA攝入，能有效減緩腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，甚至能使已經(jīng)形成的轉(zhuǎn)移灶減小或消失，同時(shí)能有效增加腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性而不增加藥物毒性

5、，對(duì)于改善腫瘤病人預(yù)后有重要意義，表明ω-3 PUFA對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有一定作用，但具體分子機(jī)制尚不十分清楚。因此，研究ω-3 PUFA對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用并探索其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)于腫瘤的預(yù)防和治療有重要意義。 本課題首先通過MTT比色實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期相的改變，觀察ω-3PUFA(EPA和DHA)對(duì)PC-3細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。再采用體外黏附實(shí)驗(yàn)，侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)觀察ω-3 PUFA對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，并

6、應(yīng)用RT-PCR，Westernblot，免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測ω-3 PUFA對(duì)腫瘤細(xì)胞Rho GTP酶mRNA、蛋白以及在細(xì)胞內(nèi)分布和表達(dá)的影響。在此基礎(chǔ)上通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法觀察ω-3 PUFA在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程中微絲和微管細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和分布的改變。通過以上實(shí)驗(yàn)，觀察ω-3 PUFA對(duì)PC-3人前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，并探討ω-3 PUFA抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中對(duì)Rho GTP酶基因表達(dá)和細(xì)胞骨架重組的影響，揭示Rho GTP酶在ω-3

7、 PUFA抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論如下： 1．MTT比色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ω-3 PUFA(EPA或DHA)對(duì)PC-3細(xì)胞均有增殖抑制作用，并隨處理濃度增加而增大，在相同處理濃度下，增殖抑制作用隨ω-3 PuFA作用時(shí)間延長而增加，表明ω-3 PUFA能有效抑制PC-3細(xì)胞增殖，并呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的檢測發(fā)現(xiàn)，60 μmol/Lω—3 PUFA處理后的PC-3細(xì)胞，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞

8、顯著增多，S+G<,2>/M細(xì)胞顯著減少，DHA處理組和對(duì)照組相比有顯著差異，細(xì)胞周期被阻滯在G<,0>/G<,1>期。 2．通過體外黏附實(shí)驗(yàn)，侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，60μmol/Lω-3 PUFA處理后的PC-3細(xì)胞，與各黏附時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組比較，在Matrjgel人工重構(gòu)基底膜上的黏附能力顯著下降，且DHA對(duì)PC-3細(xì)胞的黏附抑制作用大于EPA；體外侵襲和遷移能力也顯著下降，從Millicell小室內(nèi)侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移穿膜細(xì)

9、胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ω-3 PUFA能夠顯著抑制PC-3細(xì)胞的體外黏附性、侵襲性和遷移性。 3．RT-PCR、Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，60 μmol/L ω-3 PUFA處理后的PC-3細(xì)胞，RhoA、Rac2和Cdc42 rnRNA表達(dá)顯著下降，Rac1、Rac2和Cdc42蛋白的表達(dá)也顯著下降，且RhoA和Rac1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)減少。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ω-3 PUFA能顯著

10、抑制Rho GTP酶mRNA、蛋白及在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，表明ω-3 PUFA對(duì)Rho GTF，酶基因表達(dá)有顯著抑制作用。 4。利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)微絲和微管，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察微絲和微管結(jié)構(gòu)和分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ω-3 PuFA能顯著影響細(xì)胞骨架重組。對(duì)照組PC-3細(xì)胞內(nèi)微管主要分布于胞膜和近胞膜的胞漿部分，甲行排列成束狀或交叉排列成網(wǎng)狀，結(jié)構(gòu)清晰；微絲主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，連接成網(wǎng)狀。60μmol/L ω-3P

11、UFA處理48 h后的PC-3細(xì)胞，微絲和微管結(jié)構(gòu)顯著改變，微管長度變短，束狀結(jié)構(gòu)消失并發(fā)生斷裂，于細(xì)胞漿內(nèi)散在不均一分布或僅位于細(xì)胞一極，熒光強(qiáng)度減弱；微絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不清晰，局部出現(xiàn)溶解或斷裂。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ω-3 PUFA作用后的PC-3細(xì)胞，微絲和微管正常的結(jié)構(gòu)或在細(xì)胞內(nèi)的分布改變，表明ω-3 PUFA對(duì)腫瘤細(xì)胞骨架重組有顯著影響。 綜上所述，ω-3 PUFA不僅能顯著抑制PC-3細(xì)胞的增殖能力，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，而且能顯著