Rho GTP酶在ω-3多不飽和脂肪酸抑制腫瘤轉移中的作用.pdf

1、腫瘤是目前威脅人類健康最兇險的疾病之一，而腫瘤轉移是引起癌癥病人死亡的主要原因。腫瘤轉移的機制異常復雜并受多種因素影響，除了腫瘤細胞與組織器官微環(huán)境相互作用，機體整體調節(jié)作用外，腫瘤細胞的生物學特性(黏附性、侵襲性、遷移性)與腫瘤轉移有著密切關系。而這些生物學特性與細胞內主要由微絲和微管構成的細胞骨架密切相關，細胞骨架重組在腫瘤細胞偽足突起、細胞一細胞外基質(Excracellularmatrix，ECM)黏附、黏著斑(Focal ad

2、hesion COlnplex，F(xiàn)AC)的形成、對ECM的侵襲、在血管或淋巴管中的遷移及在新的組織器官定植生長等多個轉移環(huán)節(jié)中起關鍵作用，而這些細胞事件主要依賴Rho GTP酶調節(jié)。Rho GTP酶屬Ras超家族，是一組相對分子質量大約為20～25 kD的GTP結合蛋白，具有GTP酶活性，因此習慣被稱為Rho GTP酶，RhoA，Rac1和cdc42是目前研究最多的Rho GTP酶。Rho GTP酶是細胞骨架的關鍵調節(jié)子，能誘導肌動蛋白

3、和微管蛋白分別組裝為微絲和微管，調節(jié)腫瘤細胞的黏附、侵襲和遷移過程。Rho GTP酶是重要的腫瘤轉移相關基因，在高轉移性的腫瘤細胞及腫瘤轉移灶組織內表達異常升高，與腫瘤細胞的轉移過程密切相關，也是細胞內多條信號轉導通路的關鍵分子，抑制Rho GTP酶的活性或阻斷其介導的信號通路均可有效減弱腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。 膳食中的ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 Polyunsaturated fatty acid，ω-3 PuFA)是一

4、類具有多種生物學功能的重要營養(yǎng)素，主要包括二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acjd，DHA)，是對人體非常重要的多不飽和脂肪酸。ω-3 PUFA不僅能顯著影響多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤病人化療同時增加膳食ω-3 PUFA攝入，能有效減緩腫瘤的遠端轉移，甚至能使已經(jīng)形成的轉移灶減小或消失，同時能有效增加腫瘤對化療藥物的敏感性而不增加藥物毒性

5、，對于改善腫瘤病人預后有重要意義，表明ω-3 PUFA對腫瘤轉移有一定作用，但具體分子機制尚不十分清楚。因此，研究ω-3 PUFA對腫瘤轉移的作用并探索其抑制腫瘤轉移的分子機制，對于腫瘤的預防和治療有重要意義。 本課題首先通過MTT比色實驗和流式細胞儀測定細胞周期相的改變，觀察ω-3PUFA(EPA和DHA)對PC-3細胞增殖能力和細胞周期進程的影響。再采用體外黏附實驗，侵襲實驗和遷移實驗觀察ω-3 PUFA對腫瘤轉移的影響，并

6、應用RT-PCR，Westernblot，免疫細胞化學等方法檢測ω-3 PUFA對腫瘤細胞Rho GTP酶mRNA、蛋白以及在細胞內分布和表達的影響。在此基礎上通過免疫熒光細胞化學法觀察ω-3 PUFA在抑制腫瘤轉移過程中微絲和微管細胞骨架結構和分布的改變。通過以上實驗，觀察ω-3 PUFA對PC-3人前列腺癌細胞轉移的作用，并探討ω-3 PUFA抑制腫瘤轉移中對Rho GTP酶基因表達和細胞骨架重組的影響，揭示Rho GTP酶在ω-3

7、 PUFA抑制腫瘤轉移中的作用。 主要實驗結果和結論如下： 1．MTT比色實驗發(fā)現(xiàn)，ω-3 PUFA(EPA或DHA)對PC-3細胞均有增殖抑制作用，并隨處理濃度增加而增大，在相同處理濃度下，增殖抑制作用隨ω-3 PuFA作用時間延長而增加，表明ω-3 PUFA能有效抑制PC-3細胞增殖，并呈劑量和時間依賴關系。對細胞周期進程的檢測發(fā)現(xiàn)，60 μmol/Lω—3 PUFA處理后的PC-3細胞，G<,0>/G<,1>期細胞

8、顯著增多，S+G<,2>/M細胞顯著減少，DHA處理組和對照組相比有顯著差異，細胞周期被阻滯在G<,0>/G<,1>期。 2．通過體外黏附實驗，侵襲實驗和遷移實驗發(fā)現(xiàn)，60μmol/Lω-3 PUFA處理后的PC-3細胞，與各黏附時相點對照組比較，在Matrjgel人工重構基底膜上的黏附能力顯著下降，且DHA對PC-3細胞的黏附抑制作用大于EPA；體外侵襲和遷移能力也顯著下降，從Millicell小室內侵襲穿膜細胞數(shù)和遷移穿膜細

9、胞數(shù)均顯著低于對照組細胞。以上實驗結果表明，ω-3 PUFA能夠顯著抑制PC-3細胞的體外黏附性、侵襲性和遷移性。 3．RT-PCR、Western blot及免疫細胞化學實驗結果表明，60 μmol/L ω-3 PUFA處理后的PC-3細胞，RhoA、Rac2和Cdc42 rnRNA表達顯著下降，Rac1、Rac2和Cdc42蛋白的表達也顯著下降，且RhoA和Rac1在細胞內的表達減少。以上實驗結果顯示，ω-3 PUFA能顯著

10、抑制Rho GTP酶mRNA、蛋白及在細胞內的表達，表明ω-3 PUFA對Rho GTF，酶基因表達有顯著抑制作用。 4。利用免疫熒光細胞化學技術標記細胞內微絲和微管，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察微絲和微管結構和分布，結果發(fā)現(xiàn)，ω-3 PuFA能顯著影響細胞骨架重組。對照組PC-3細胞內微管主要分布于胞膜和近胞膜的胞漿部分，甲行排列成束狀或交叉排列成網(wǎng)狀，結構清晰；微絲主要分布于細胞膜和細胞漿，連接成網(wǎng)狀。60μmol/L ω-3P

11、UFA處理48 h后的PC-3細胞，微絲和微管結構顯著改變，微管長度變短，束狀結構消失并發(fā)生斷裂，于細胞漿內散在不均一分布或僅位于細胞一極，熒光強度減弱；微絲網(wǎng)狀結構不清晰，局部出現(xiàn)溶解或斷裂。實驗結果表明，ω-3 PUFA作用后的PC-3細胞，微絲和微管正常的結構或在細胞內的分布改變，表明ω-3 PUFA對腫瘤細胞骨架重組有顯著影響。 綜上所述，ω-3 PUFA不僅能顯著抑制PC-3細胞的增殖能力，阻斷細胞周期進程，而且能顯著