α-1,2巖藻糖基轉移酶II對肺腺癌細胞A549遷移和凋亡功能的影響及機理探討.pdf

1、目的：
　　蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾，糖鏈的改變會直接影響蛋白的結構和生物學功能，目前眾多研究表明糖基化修飾與腫瘤有著密切的關系，糖基化異常的基礎是糖基轉移酶的異常，因此對糖基轉移酶的研究已成為腫瘤研究的又一熱點。巖藻糖基轉移酶（FucTs）催化蛋白的巖藻糖基化修飾，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關；α-1,2巖藻糖基轉移酶II（FUT2）是該家族成員之一，本課題組的前期研究顯示其在肺腺癌中呈高表達狀態(tài)，與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉移

2、有著密切關系，但其具體作用機理尚不清楚。本實驗以A549細胞為研究對象，探討FUT2對肺腺癌遷移和凋亡的影響以及與經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路和Notch信號通路的相關性，明確FUT2在肺腺癌遷移和凋亡中的作用機制，進一步為肺腺癌的診斷及治療提供潛在的標靶。
　　方法：
　?。?）利用脂質(zhì)體轉染技術把FUT2的RNA干擾質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-FUT2和對照載體pGPU6/GFP/Neo-shNC轉入肺腺癌

3、細胞A549中，經(jīng)過抗性藥物篩選，構建FUT2低表達的A549穩(wěn)轉細胞株。
　?。?）采用Transwell基質(zhì)膠實驗檢測肺腺癌A549細胞的遷移侵襲能力；平板克隆實驗檢測肺腺癌A549細胞生長能力；流式細胞儀檢測肺腺癌A549細胞周期分布情況和凋亡情況。
　?。?）采用Western Blot檢測細胞相關黏附因子β-catenin和Icam-1的蛋白表達情況，以及 Wnt信號通路中GSK3β、磷酸化β-catenin和下游

4、因子CyclinD1、C-myc的蛋白表達情況。
　?。?）采用膜漿分離和核漿分離檢測Wnt經(jīng)典信號通路中關鍵核心因子β-catenin在細胞膜、漿、核中的蛋白分布情況。
　?。?）采用Western Blot檢測細胞相關凋亡因子Bcl-2、P53、Caspase3及其剪切體、PARP及其剪切體的蛋白表達情況。
　?。?）建立裸鼠皮下成瘤模型：將100μL4×107/mL A549細胞懸液通過裸鼠腹部右側皮下注射于BA

5、LB/c-nu裸鼠皮下。6周后取出腫瘤組織，觀察，測量，稱重以及免疫組化檢測組織中FUT2的蛋白表達水平。
　?。?）采用Western Blot檢測Notch信號通路受體剪切體NICD和下游因子HES1的蛋白表達情況。
　?。?）免疫共沉淀（Co-IP）實驗檢測FUT2與NICD的相互作用關系。
　?。?）用Notch信號通路抑制劑FLI-06處理后，Western Blot檢測NICD和下游因子HES1的蛋白表達情

6、況以及其它相關因子GSK3β和磷酸化β-catenin蛋白表達情況。
　?。?0）用Notch信號通路抑制劑FLI-06處理高表FUT2后的A549細胞，Western Blot檢測NICD和下游因子HES1的蛋白表達情況。
　　結果：
　　（1）經(jīng)過藥物的篩選成功得到穩(wěn)定表達的細胞株，實時熒光定量PCR（RT-PCR）和Western Blot對目的基因和蛋白的檢測結果顯示：轉入RNA干擾組與未轉染組、空載組相比，F(xiàn)

7、UT2的mRNA水平和蛋白水平表達均降低。
　?。?）Transwell基質(zhì)膠實驗結果表明低表FUT2后，細胞遷移侵襲能力顯著降低；平板克隆實驗結果表明FUT2低表組與空載組相比細胞生長克隆能力降低；流式細胞儀檢測結果表明FUT2低表組A549細胞處在S期和G2期的比例明顯降低，且細胞凋亡率增加。
　?。?）細胞黏附因子β-catenin的總表達量在FUT2低表達細胞中不變，而磷酸化的β-catenin的表達量升高且Wnt/

8、β-catenin經(jīng)典信號通路的GSK3β上升，下游靶因子 CyclinD1、C-myc在FUT2低表組中均顯著下調(diào)。
　　（4）膜漿核分離檢測結果表明β-catenin在細胞膜分布增高、核分布降低。
　?。?）在FUT2低表細胞中，細胞凋亡因子Bcl-2的蛋白表達水平下降而P53的蛋白表達水平上升，Caspase3的蛋白表達水平下降，其剪切體（cleaved Caspase3）增多，PARP的剪切體cleaved PARP

9、也增多。
　?。?）裸鼠皮下成瘤模型結果顯示，干擾FUT2的表達之后，皮下瘤組織生長明顯減慢，6周后的瘤組織的體積和重量也較低。
　?。?）Notch信號通路中FUT2低表組的NICD蛋白表達水平下降，且其下游因子HES1的蛋白表達水平也下降。
　　（8）免疫共沉淀（Co-IP）實驗結果表明FUT2與NICD存在相互作用。
　　（9）FLI-06抑制劑作用于A549后，NICD和下游因子HES1的蛋白表達水平下降

10、，GSK3β和磷酸化β-catenin蛋白表達水平上升。
　?。?0）在FUT2高表后的A549細胞中，NICD和下游因子HES1的蛋白表達水平上升，用FLI-06抑制劑處理高表FUT2的A549細胞，NICD和下游因子HES1的蛋白表達水平下降。
　　結論：
　　本實驗成功構建了FUT2低表達肺腺癌A549細胞株，實驗結果表明低表FUT2能抑制肺腺癌細胞A549的生長和遷移，促進細胞凋亡。FUT2可能是通過影響β-c