α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞RMG-I蛋白組學(xué)變化的影響.pdf

1、卵巢癌在婦科惡性腫瘤中病死率居首位，五年生存率一直徘徊在20～30％，主要原因是：①難以早期發(fā)現(xiàn)；②術(shù)后易復(fù)發(fā)；③化療易產(chǎn)生多藥耐藥。卵巢癌的發(fā)生機(jī)制一直是婦科腫瘤基礎(chǔ)研究與臨床研究的重點(diǎn)，掌握卵巢腫瘤惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制對(duì)于卵巢癌的預(yù)防、診斷及治療十分重要。上述問(wèn)題的解決都有賴于對(duì)其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號(hào)分子的構(gòu)成及其相互作用關(guān)系的闡明。
　　 細(xì)胞膜上存在的糖復(fù)合物與細(xì)胞間的相互黏附、識(shí)別、細(xì)胞惡變、侵襲及轉(zhuǎn)移等細(xì)胞生物

2、學(xué)特性密切相關(guān)。細(xì)胞癌變后細(xì)胞中的糖復(fù)合物，特別是細(xì)胞膜上糖復(fù)合物中的糖鏈部分發(fā)生結(jié)構(gòu)和量的變化，使其作為腫瘤標(biāo)志物在臨床工作中被廣泛應(yīng)用。在卵巢癌，主要表現(xiàn)為Ⅱ型糖鏈的變化，如Lewisy及Lewis x等組織-血型抗原的改變。75%的卵巢癌出現(xiàn)Lewisy不同程度的高表達(dá)；上皮性卵巢腫瘤標(biāo)志物CA125的結(jié)構(gòu)中含有Lewisy結(jié)構(gòu)，說(shuō)明Lewisy與上皮性卵巢腫瘤關(guān)系密切。Lewisy是雙巖藻糖基化的寡糖。巖藻糖是終末糖基，其加入后

3、糖鏈的加工終止，糖鏈的結(jié)構(gòu)不再改變。正常情況下，Lewisy抗原主要表達(dá)于胚胎發(fā)生時(shí)期，在成人其表達(dá)則限于粒細(xì)胞和上皮組織細(xì)胞表面。當(dāng)上皮組織發(fā)生癌變時(shí)，60%～90%的病人出現(xiàn)Lewisy抗原表達(dá)明顯增高，如卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌等，且Lewisy的水平與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。
　　 Lewisy的上述特點(diǎn)使其成為腫瘤化療的候選藥靶。雖然目前針對(duì)Lewisy抗原靶點(diǎn)的治療藥物已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，但是L

4、ewisy與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制研究甚少，了解有哪些蛋白參與其過(guò)程非常重要。α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(futl)是Lewisy合成的關(guān)鍵酶，我們?cè)谇捌谘芯抗ぷ髦?，通過(guò)將人futl基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞系RMG-I中，成功構(gòu)建了Lewisy高表達(dá)細(xì)胞模型RMG-I-H。并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)系列研究，發(fā)現(xiàn)Lewisy作為眾多受體表面的一部分，其表達(dá)增加活化受體進(jìn)而激活了下游的PI3K/Akt和Raf/MEK/MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)

5、致細(xì)胞核內(nèi)HER2/neu等基因轉(zhuǎn)錄的加速，刺激DNA合成，加快細(xì)胞跳過(guò)G1期限制點(diǎn)進(jìn)入S期，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等惡性生物學(xué)行為增強(qiáng)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，Lewisy作用機(jī)制仍然不十分清楚。本文利用已建立的卵巢癌細(xì)胞模型RMG-I-H與其親本細(xì)胞系RMG-I進(jìn)行研究，目的在于探索Lewisy高表達(dá)細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白的構(gòu)成、相互作用關(guān)系及其與腫瘤生物學(xué)行為的相關(guān)性。為進(jìn)一步研究Lewisy抗原高表達(dá)在卵巢癌中的

6、作用機(jī)制及相關(guān)生物治療提供科研思路和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分：將轉(zhuǎn)染futl基因與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的細(xì)胞系RMG-I-H與RMG-I-C進(jìn)行2-DE分析與MALDI-TOF-MS鑒定，從而獲得Lewisy高表達(dá)細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白的構(gòu)成。利用蛋白間相互作用預(yù)測(cè)軟件STRING，將蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果與相應(yīng)已完成的基因芯片結(jié)果聯(lián)合建模，構(gòu)建蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)檢索UniPro蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析差異表達(dá)蛋白的

7、生物學(xué)作用與細(xì)胞定位。利用文獻(xiàn)檢索軟件PubMatrix建立檢索矩陣，分析Lewisy高表達(dá)細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白與腫瘤惡性生物學(xué)行為的相關(guān)性。
　　 第二部分：選取蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中與PI3K信號(hào)通路密切相關(guān)的肌醇單磷酸酶IMPA1作為研究對(duì)象，利用Western blot方法分別檢測(cè)三對(duì)細(xì)胞系RMG-I與RMG-I-H(Lewisy相關(guān))，SKOV3與SKOV3/DDP(順鉑耐藥相關(guān)，Lewisy相關(guān))，HP8910與HP891

8、0/PM(轉(zhuǎn)移相關(guān)，Lewisy相關(guān))中IMPA1表達(dá)水平；利用Lewisy單克隆抗體對(duì)RMG-I-H細(xì)胞表面抗原進(jìn)行阻斷，檢測(cè)阻斷后細(xì)胞中IMPA1表達(dá)量與之是否存在時(shí)間依賴性與劑量依賴關(guān)系。采用免疫化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞爬片與臨床病理切片中目的蛋白的定位與表達(dá)水平，并分析目的蛋白與各種病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：蛋白質(zhì)組學(xué)方法共鑒定出21個(gè)差異表達(dá)蛋白，主要分布于胞質(zhì)與胞核，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增殖、凋亡

9、及物質(zhì)代謝等過(guò)程。蛋白質(zhì)相互作用建模發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)作用核心：PCNA和ERBB2。文獻(xiàn)挖掘發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中有35%與腫瘤密切相關(guān)，主要參與增殖與凋亡；基因組學(xué)結(jié)果中有50%與腫瘤密切相關(guān)，主要參與增殖與粘附。
　　 第二部分：IMPA1在耐藥、轉(zhuǎn)移、Lewisy高表達(dá)細(xì)胞中高表達(dá)；IMPA1表達(dá)對(duì)Lewisy單克隆抗體阻斷作用存在明確的時(shí)間與劑量相關(guān)性，低濃度時(shí)下調(diào)，中、高濃度則強(qiáng)烈上調(diào)；細(xì)胞和組織免疫化學(xué)結(jié)果證明IMPA1在胞

10、漿及胞核內(nèi)均有表達(dá)，以胞漿表達(dá)為主。核表達(dá)陽(yáng)性率在年輕病人和粘液性卵巢癌中明顯增高。
　　 結(jié)論：
　　 1、文獻(xiàn)挖掘結(jié)果提示Lewisy高表達(dá)細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白與腫瘤增殖、耐藥、轉(zhuǎn)移、粘附、凋亡等生物學(xué)行為相關(guān)，尤其與增殖和粘附的關(guān)系最為密切。
　　 2、PCNA與ERBB2是差異表達(dá)蛋白相互作用預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)模型的核心蛋白，可能在Lewisy高表達(dá)卵巢上皮腫瘤的生物學(xué)特性變化機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
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