Lewis y抗原對(duì)人卵巢癌細(xì)胞RMG-I-H部分耐藥相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過(guò)檢測(cè)α1，2—FT基因轉(zhuǎn)染前后的人卵巢癌細(xì)胞系RMG—I和RMG—I—H及Lewisy單克隆抗體處理前后細(xì)胞系RMG—I—H部分耐藥相關(guān)蛋白基因：多藥耐藥基因—1(MDR—1)，多藥耐藥相關(guān)蛋白—1(MRP—1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白—2(MRP—2)、蛋白激酶C-α(PKC-α)及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)的表達(dá)差異，探討Lewisy抗原與耐藥相關(guān)蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)的相關(guān)性，為研究Lewisy抗原在人上皮性卵巢癌耐藥機(jī)制中的作用

2、奠定基礎(chǔ)。 方法：①RMG—I為人卵巢透明細(xì)胞癌株，RMG—I—H為RMG—I穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1(-)—HFUT—H(含1，2—FT基因)獲得的Lewisy高表達(dá)細(xì)胞系。②取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RMG—I—H及RMG—I細(xì)胞，RNAout試劑常規(guī)提取細(xì)胞總RNA。各取4μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為70℃10 min，冰上冷卻2 min以上，42℃60 min，70℃15 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條

3、件為：94℃3 min后，以適當(dāng)?shù)难h(huán)數(shù)進(jìn)行以下反應(yīng)：94℃40 s；退火溫度1 min；72℃1 min，最后為72℃7 min。PCR產(chǎn)物在3.0％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，經(jīng)電泳凝膠成象分析儀拍照并分析處理。以各自內(nèi)參照β—actin表達(dá)量為基準(zhǔn)計(jì)算各條帶的相對(duì)含量，進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。③取RMG—I—H及RMG—I細(xì)胞，各懸浮于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中，接種到預(yù)先放置7 mm×22 mm蓋玻片的

4、培養(yǎng)皿(35 mm)中，置CO2孵箱培養(yǎng)2d，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層，取出蓋玻片，浸入PBS洗2次，4％多聚甲醛固定，染色方法按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。一抗兔抗人P—gp多克隆抗體1:100稀釋。在40倍鏡下觀察，以細(xì)胞漿、細(xì)胞膜有棕黃色顆粒著色為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。圖像分析軟件Meta Morph分析結(jié)果。④取RMG—I—H及RMG—I細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，記數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，選取10只4～6周齡健康雌性裸鼠，體重(

5、20.4±0.6)g，隨機(jī)分成兩組，于背部皮下注射細(xì)胞懸液0.3ml。裸鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，定期觀察小鼠精神、飲食及排便情況。五周后處死全部裸鼠，取出皮下瘤塊，分離，制備成石臘塊。⑤取指數(shù)生長(zhǎng)期RMG—I—H細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，2×105/培養(yǎng)皿接種子7個(gè)35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)36 h后棄去培養(yǎng)液，收集1個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，提取RNA，以此時(shí)作為0時(shí)間點(diǎn)。同時(shí)另6個(gè)培養(yǎng)皿加入含2％胎牛血清的培養(yǎng)液，其中3個(gè)培養(yǎng)皿中加入抗Lewisy單

6、克隆抗體，使其終濃度為10 ug/ml，作為實(shí)驗(yàn)組(抗體處理組)：不予處理的3個(gè)培養(yǎng)皿作為對(duì)照組(非處理組)。再繼續(xù)培養(yǎng)6，9，24 h后，分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各一個(gè)培養(yǎng)皿，提取細(xì)胞RNA，進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)MDR—1、PKC-α、MRP—1、MRP—2及TopoⅠ的mRNA的表達(dá)。⑥應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件，檢測(cè)數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析方法。P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果

7、：⑴RT-PCR檢測(cè)結(jié)果證明，RMG—I—H細(xì)胞中PKC-α、TopoⅠ、MRP—1及MRP—2的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.46±0.02、0.82±0.08、0.66±0.07和0.44±0.08，與其在RMG—I中的相對(duì)表達(dá)量0.27±0.05、0.52±0.04、0.34±0.12及0.23±0.05相比均明顯增高(P均<0.05)；而MDR—1在RMG—I—H細(xì)胞中(0.26±0.05)的相對(duì)表達(dá)量低于其在RMG—I中(0.4

8、5±0.08)的表達(dá)P<0.05。⑵SP染色結(jié)果表明，在RMG—I—H細(xì)胞中P—gp染色陽(yáng)性顆粒呈棕黃色或棕褐色，廣泛分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，其累積光密度為29.75±2.01；在RMG—I細(xì)胞中P—gp染色陽(yáng)性顆粒呈淡黃色，彌散分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，累積光密度為17.05±0.56，RMG—I—H細(xì)胞的染色強(qiáng)度明顯高于RMG—I(P=0.037)。⑶P—gp在裸鼠皮下移植瘤組織中染色狀態(tài)如同細(xì)胞學(xué)，在RMG—I—H細(xì)胞移植瘤的組織中的染

9、色較強(qiáng)，呈棕褐色或棕黃色，累積光密度為49.58±6.93；而在RMG—I細(xì)胞移植瘤的組織中染色呈淡棕黃色，累積光密度為20.09±4.09(P=0.023)。⑷RMG—I—H細(xì)胞Lewisy糖基抗原被濃度為10 ug/ml的Lewisy單克隆抗體封閉后，MDR—1、MRP—1、MRP—2、PKC-α及TopoⅠmRNA的表達(dá)強(qiáng)度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低(P均<0.05)，在24 h達(dá)到最低，而非處理組的變化則不明顯(P均>0.05)。

10、另外，在6 h這一時(shí)間點(diǎn)抗體處理組的MDR—1、MRP—1 MRP—2、PKC-α及TopoⅠ的mRNA相對(duì)含量(0.36±0.05、0.18±0.02、0.15±0.04、0.40±0.09、0.42±0.03)均低于非處理組(0.70±0.07、0.80±0.04、0.51±0.08、0.74±0.13、0.77±0.13)，P均<0.05，其抑制率分別為48.55％、77.50％、70.18％、45.86％和46.13％。