低氘水對人肝癌細胞增殖和侵襲力抑制作用及HepG2細胞miRNAs陣列分析.pdf

1、目的：⑴比較不同氘體積濃度對人肝癌細胞株及正常肝細胞的增殖及侵襲力的影響作用。⑵以HepG2細胞為代表，檢測與分析低氘水對HepG2處理后的miRNAs差異表達譜，初步探討低氘水抗肝癌的可能機制。
　　 方法：①MTT法檢測低氘水對肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和正常人肝細胞LO2增值的抑制作用;平板克隆比較不同濃度低氘水作用肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和正常人肝細胞LO2后形成的克隆集落數(shù)的差異;細胞

2、劃痕實驗檢測低氘水對肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1和LO2細胞侵襲遷移能力;流式細胞儀檢測低氘水對HepG2、7402、SK-Hep-1和LO2細胞周期的變化影響;ATP酶試劑盒測試低氘水對HepG2、SK-Hep-1、7402和LO2細胞的ATP酶表達變化;Western-blot檢測低氘水對HepG2、SK-Hep-1、7402和LO2細胞的cylinA、cylinE2、ATP、P21、Phospho-wee1、PCNA

3、等蛋白表達情況。②以HepG2細胞為代表，通過基因芯片分析低氘水對HepG2細胞的miRNAs表達譜;qRT-PCR驗證低氘水對HepG2細胞的miRNAs差異表達譜;生物信息學預測靶基因及其功能;劃痕實驗檢測HepG2細胞轉(zhuǎn)染目的miRNAs后細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力;RT-PCR檢測HepG2細胞轉(zhuǎn)染目的miRNAs inhibit和mimics后的基因表達變化。
　　 結(jié)果：⑴低氘水對肝癌細胞和正常肝細胞的增殖和侵襲力影響:隨著培

4、養(yǎng)基中氘含量下降，在平板克隆、細胞劃痕和MTT實驗中，肝癌HepG2、7402、SK-Hep-1細胞集落生成以及細胞游走侵襲能力顯著下降(P＜0.05)，但低氘水對人正常肝細胞LO2生長具有促進作用。⑵低氘水能誘導肝癌細胞生長周期阻滯:流式細胞儀檢測顯示，各肝癌細胞經(jīng)低氘水處理后細胞G1、G2期靜止或略微增加，S期減少(P＜0.05)，而對正常肝細胞生長周期無明顯抑制。⑶低氘水抑制肝癌細胞ATP酶活力:ATP酶試劑盒檢測結(jié)果顯示低氘水能

5、顯著抑制肝癌細胞Na+K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和T-ATP酶活力(P＜0.01）。⑷低氘水影響肝癌細胞相關(guān)周期蛋白表達:western-blot檢測結(jié)果顯示P21蛋白表達水平顯著上調(diào)，clylinE2、ATP、cylinA、Phospho-wee1、PCNA等顯著下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。⑸低氘水對肝癌細胞miRNAs表達譜差異影響:Affymetrix microRNA芯片比較低氘水(50 ppm)與普通

6、水(150 ppm)處理肝細癌胞HepG2后，miRNAs表達譜差異結(jié)果顯示差異倍數(shù)在兩倍以上的miRNA有182個，其中96個高表達，86個低表達;qRT-PCR驗證低氘水對肝癌HepG2細胞的miRNAs差異表達譜中的hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p的表達，結(jié)果顯示hsa-mir-143(4.6025±1.214倍),hsa-mir-145-3p(3.8450±2.343倍),hsa

7、-mir-145-5p(3.20750±2.154倍)，(P＜0.05)。⑹hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p調(diào)控ABCC4和ATP11C基因的表達:生物信息學預測結(jié)果顯示hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p調(diào)控的靶基因與腫瘤的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥等相關(guān);miRNAs轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后劃痕實驗結(jié)果顯示:ABCC4和ATP11C可能是hsa-mi

8、R-143、hsa-miR-145-3p、hsa-miR-145-5p調(diào)控的靶基因（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：①低氘水對人肝癌細胞的增殖及侵襲力具有顯著的抑制效應，對正常肝細胞無毒副作用。②低氘水顯著影響肝癌相關(guān)細胞周期蛋白的表達，通過水通道和ATP酶活性等誘導肝癌細胞G1、G2期的靜止和S期阻滯，可能是抑制肝癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的機制之一。③低氘水顯著上調(diào)hsa-miR-143、hsa-miR-145-3p、hsa-m