小鼠Map2k6基因區(qū)域三個片段的敲除.pdf

1、目的：
　　 基因敲除技術(shù)(Gene Knockout)是一種新型分子生物學技術(shù),是利用DNA同源重組使細胞中特定的基因失活或缺失的技術(shù)。該技術(shù)自上世紀80年代末誕生以來,已被廣泛應用于功能基因組學等研究領(lǐng)域。由于小鼠基因組與人類基因組具有高度相似性,通過該技術(shù)構(gòu)建出來的基因敲除小鼠模型已成為研究人類疾病強有力的工具和手段。
　　 先天性全身終毛增多癥(Congenital Generalized Hypertricho

2、sis Terminalis,CGHT,MIM ID＃135400)是一種非常罕見的人類疾病,俗稱“狼人綜合征”(Werewolf Syndrome)。其特點是非雄激素依賴性全身性毛發(fā)過度生長,常伴發(fā)牙齦增生和面部特征畸形,且不受性別、年齡和種族限制,曾一度被認為是一種返祖現(xiàn)象(Atavism)。2009年,本課題組在國際上首次確定人類染色體17q24.2-q24.3區(qū)域拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation,CNV)對

3、CGHT發(fā)生起到?jīng)Q定性作用,并提出該區(qū)域內(nèi)的Map2k6等4個蛋白編碼基因為CGHT的致病候選基因,但該病發(fā)生的具體分子機制仍不甚明了,而且病例少、病理組織取材困難等限制無疑又進一步增加了研究的難度。
　　 作為CGHT致病主要候選基因之一的Map2k6基因,負責編碼促分裂原活化蛋白激酶激酶蛋白。但據(jù)文獻報道,一名包含有Map2k6基因在內(nèi)的染色體17q24.2-q24.3區(qū)域微缺失的病人并沒有出現(xiàn)CGHT相關(guān)的疾病特征。并且,

4、Map2k6基因敲除小鼠模型同樣也沒有表現(xiàn)出明顯的毛發(fā)生長方面的異常。但值得注意的是,目前構(gòu)建的Map2k6基因敲除模型主要是敲除該基因的編碼序列以破壞其蛋白表達,而針對該基因區(qū)域潛在調(diào)控相關(guān)元件的研究甚少。小鼠的Map2k6基因位于染色體11qE2區(qū)域,通過比較基因組學研究我們發(fā)現(xiàn),該基因區(qū)域染色體位置110,260,185-110,264,752和110,362,441-110,367,890(UCSC數(shù)據(jù)庫July2007,NCB

5、I37/mm9)各有一段保守的區(qū)域,并且其3'非編碼區(qū)染色體位置110,378,469-110,387,006有一段表達序列標簽(Expressed Sequence Tags,EST)集中的區(qū)域,而此類區(qū)域常被認為具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等重要的功能。
　　 本課題旨在針對上述三個DNA片段分別構(gòu)建基因打靶載體,并用于產(chǎn)生基因敲除小鼠胚胎干細胞克隆,進而生成相應的基因敲除小鼠模型。該敲除模型的建立將有助于了解Map2k6基因本身

6、及其對鄰近基因表達可能存在的調(diào)控模式,進而為將來最終闡明CGHT的具體分子發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、對小鼠Map2k6基因區(qū)域進行比較基因組學分析,確定該基因的5'非翻譯區(qū)(Untranslated Region,UTR)至內(nèi)含子1、內(nèi)含子10以及3'非編碼區(qū)三段敲除區(qū)域,即染色體11qE2位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378

7、,469-110,387,006(UCSC數(shù)據(jù)庫July2007,NCBI37/mm9),大小分別為4,568 bp、5,450 bp、8,538 bp,并在理論上設計針對上述三個區(qū)域的置換型基因打靶載體。
　　 2、以覆蓋以上區(qū)域的BAC克隆DNA為模板,利用PCR分別擴增三個打靶載體對應的六段同源臂序列,并按照理論設計的先后順序分別在基因敲除通用載體pL452骨架上安裝每個打靶載體兩側(cè)的同源臂,最終通過測序確認打靶載體的序列

8、信息正確。
　　 3、復蘇小鼠胚胎干細胞系A(chǔ)B2.2和JMSA3,并培養(yǎng)調(diào)整到良好的生長狀態(tài),取部分細胞做囊胚注射來驗證其多能性(Pluripoteney)。然后,利用電穿孔(Electroporation)的方法將線性化的三個基因打靶載體分別導入AB2.2和JM8A3中,在G418藥物篩選后,挑選存活下來并具有良好細胞形態(tài)的細胞克隆進行培養(yǎng)、增殖和保存。最后,提取這些細胞克隆的基因組DNA,利用PCR和SouthernBlot

9、的方法從中鑒定出正確的基因敲除細胞克隆。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建針對小鼠Map2k6基因區(qū)域、染色體11qE2區(qū)位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378,469-110,387,006,大小分別為4,568 bp、5,450 bp、8,538 bp的三個置換型基因打靶載體(分別命名為KO-1、KO-2和KO-3),其線性化后長度分別為14

10、,585 bp、14,110 bp、12,630 bp,并均已測序確認。
　　 2、將線性化的三個打靶載體導入小鼠胚胎干細胞系A(chǔ)B2.2和JM8A3中,經(jīng)G418藥物選擇后,AB2.2分別生長出202、76、107個克隆,從中挑取96、44、48個克隆進行培養(yǎng)鑒定;JM8A3分別生長出305、176、193個克隆,從其中挑取180、129、156個克隆進行培養(yǎng)鑒定。目前,已獲得7個KO-1基因敲除的JM8A3細胞克隆;KO-2和

11、KO-3經(jīng)過PCR初步篩選也分別得到了30和36個可能為同源重組陽性的ES細胞克隆,有待進一步鑒定。
　　 結(jié)論：
　　 本研究經(jīng)初步鑒定獲得了小鼠Map2k6基因區(qū)域三個片段,即染色體11qE2區(qū)位置110,260,185-110,264,752、110,362,441-110,367,890、110,378,469-110,387,006的DNA序列,被靶向敲除的三種小鼠胚胎干細胞系,并用于建立相應區(qū)域的“基因敲除”