小鼠EMSP1基因敲除載體構(gòu)建及ES細(xì)胞飼養(yǎng)層制作研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞體外成功培養(yǎng)與基因打靶技術(shù)相結(jié)合使人類可以改變動物的遺傳性狀，獲得人為改造的動物模型。建立小鼠模型是基因打靶的主要熱點(diǎn)，首先在胚胎干細(xì)胞水平進(jìn)行操作，獲得表達(dá)目的基因的單克隆細(xì)胞，爾后將細(xì)胞進(jìn)行囊胚腔注射，得到表達(dá)目的基因的嵌合體小鼠，再進(jìn)一步培育出整合于生殖系的小鼠品系，這一套技術(shù)路線在制備基因剔除小鼠時已經(jīng)被成功地運(yùn)用。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)之一是可以對每個單克隆細(xì)胞進(jìn)行分析，并由此培育出單克隆細(xì)胞發(fā)育而來的小鼠。同時，本實(shí)驗(yàn)過程中

2、采用的基因敲除及胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為將來開展動物基因敲除奠定技術(shù)基礎(chǔ)。 本研究對EMSP1基因組序列進(jìn)行分析并結(jié)合GenBank上提供的小鼠釉基質(zhì)絲氨酸蛋白酶基因序列(10134bp)，采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)兩對引物，以129小鼠尾采血提取得到的DNA為模板，分別擴(kuò)增長為5.0kb和1.7kb的片段作為同源長短臂。然后將回收的同源長短臂克隆入pGEM -T載體上，經(jīng)過PCR及酶切鑒定，以及DNA核苷酸序列分析，證實(shí)長短臂的

3、同源率分別為97.43％和98.10％。將同源長臂經(jīng)Sal Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切，同源短臂經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后分別插入通用型基因敲除載體pSSC-9的正向篩選基因Neo兩側(cè)多克隆位點(diǎn)，成功構(gòu)建了小鼠EMSP1基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm。 在胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層制作中選用11.5～14.5天ICR小鼠胚胎為材料，采用膠原酶消化的方法，分離成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)幾代去除雜細(xì)胞后用于小鼠胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層制作實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)

4、狀態(tài)良好的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)后，利用不同濃度的絲裂霉素C處理適當(dāng)時間且計(jì)算好細(xì)胞數(shù)后，鋪成單細(xì)胞層的胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層，體外培養(yǎng)觀察飼養(yǎng)層細(xì)胞的生長狀態(tài)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析比較認(rèn)為：以12.5天ICR小鼠胚胎為材料的成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)的效果良好，原代培養(yǎng)的第二代到第五代可以用于胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層的制作。當(dāng)絲裂霉素C處于10mg/L的濃度時，處理細(xì)胞濃度為3×10<'5>個/ml的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞2小時，獲得的飼養(yǎng)層細(xì)胞狀態(tài)較好，符合胚胎干細(xì)胞