條件性敲除小鼠卵母細胞ggps1基因及其對繁殖性狀的影響.pdf

1、基因打靶技術是定向改變或修飾生物活體遺傳信息的實驗手段?；虼虬行揎椇筮z傳信息能夠在生物體內(nèi)遺傳并表現(xiàn)這些突變的性狀，這為研究特定基因的功能、疾病的診斷治療和藥物篩選評價等提供了可能。基因打靶技術使研究者可以在生物體整體水平、組織水平、細胞水平、分子水平各個層次上系統(tǒng)的研究基因功能。同源重組是指發(fā)生在減數(shù)分裂或者有絲分裂過程中相同或相似DNA序列之間的重組。它通常通過一對同源非姊妹染色單體之間的斷裂而產(chǎn)生新的重組片段。胚胎干細胞是具有無

2、限分裂能力的細胞，它能通過不對稱分裂在復制自己的同時產(chǎn)生不同類型的細胞。胚胎干細胞技術和同源重組技術的發(fā)展使基因打靶技術常規(guī)化。
　　 GGPS1蛋白是異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶家族中的一員，具有GGPP合酶活性，能夠催化法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)和異戊烯焦磷酸(isopentenyldiphosphate，IPP)縮合成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophospha

3、te，GGPP)的反應。FPP不僅是合成膽固醇的中間產(chǎn)物，還是類異戊二烯化合物（isoprenoid）如牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(GGPP)、多萜醇(dolichol)和泛醌(CoQ)合成的前體。FPP和GGPP還是蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾的底物。通過添加疏水的異戊二烯基團，蛋白質(zhì)能夠錨定在細胞膜上參與對細胞生長、分化、細胞骨架形成和囊泡輸?shù)日{(diào)控。
　　 Cre重組酶能夠介導兩個loxp位點之間的特異性重組。Cre-loxp系統(tǒng)由于它的

4、穩(wěn)定高效被廣泛應用于建立基因敲除小鼠模型。采用正負雙篩選策略，通過在ggps1基因外顯子3和外顯子4的兩端插入loxp位點和neo正向篩選基因，在靶基因3'同源臂的外端，插入胸苷激酶基因TK作為負篩選基因，經(jīng)過打靶載體的構(gòu)建及驗證、轉(zhuǎn)染胚胎干細胞、囊胚腔注射、胚胎移植代孕母鼠過程，得到了對ggps1基因遺傳修飾過的小鼠。ggps1基因遺傳修飾過的小鼠再與卵母細胞特異性表達Cre酶的小鼠（ZP3-Cre）交配，產(chǎn)生的后代就有卵母細胞特異性

5、敲除ggps1基因的小鼠。
　　 ZP3是卵母細胞特異性表達的透明帶蛋白3，在卵泡被激活發(fā)育后開始表達。卵母細胞ZP3表達后，ZP3啟動子調(diào)控下的Cre酶也將會表達，Cre酶會識別兩個序列相同的Loxp位點之間的序列并將其刪除。卵母細胞中的ggps1基因就是在此時被敲除的。此時的小鼠大約在出生后一周。經(jīng)過長期配對實驗發(fā)現(xiàn)，雜合子小鼠與野生型小鼠繁殖性狀無差異;純合子ZP3-Cre/ggps1-/-與雜合子ZP3-Cre/ggps

6、1+/-或野生型小鼠相比，平均窩產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)仔窩數(shù)均顯著減少。為了找到純合子ZP3-Cre/ggps1-/-與雜合子ZP3-Cre/ggps1+/-繁殖性狀差異的原因，分析比較了出生后10天、14天、22天、28-30天、35-38天的卵巢切片。結(jié)果顯示純合子ZP3-Cre/ggps1-/-與雜合子ZP3-Cre/ggps1+/-卵巢發(fā)育在出生后兩周就有差異。主要表現(xiàn)在出生后兩周次級卵泡(4型)過早形成卵泡腔，同時伴隨卵巢血管發(fā)育變快，卵

7、泡顆粒細胞肥大、不對稱生長及多卵卵泡現(xiàn)象。至四周齡時純合子ZP3-Cre/ggps1-/-小鼠卵巢外觀明顯小于雜合子ZP3-Cre/ggps1+/-，卵巢重量比較兩組差異顯著。卵巢連續(xù)切片顯示純合子ZP3-Cre/ggps1-/-小鼠大量次級卵泡中的卵母細胞皺縮退化、并有卵泡膜細胞肥大增生和黃體化樣變化，盡管腹腔注射PMSG后卵巢中次級卵泡形態(tài)似乎正常，但是大量有腔卵泡和排卵前卵泡形成類似黃體樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)過PMSG和HCG處理后，純合子Z

8、P3-Cre/ggps1-/-小鼠排卵數(shù)顯著少于雜合子ZP3-Cre/ggps1+/-，并且純合子ZP3-Cre/ggps1-/-小鼠排除的卵母細胞形態(tài)異常，GV期卵母細胞顯著少于對照組，卵母細胞體外受精率和受精后早期胚胎發(fā)育能力也顯著低于對照組。在對性成熟后的8-10周小鼠卵巢切片研究發(fā)現(xiàn)，每個發(fā)情周期中卵泡發(fā)育也同四周齡小鼠一致，大量次級卵泡發(fā)育停滯在早期有腔卵泡階段，卵泡類黃體樣變化。
　　 TGFβ家族成員中GDF9和B

9、MP15是卵泡發(fā)育過程中的主要調(diào)控因子。TGFβ家族成員發(fā)揮作用需要smad家族成員的介導激活。Smad4即為通用型TGFβ介導調(diào)節(jié)因子。ZP3-Cre/ggps1-/-小鼠的繁殖缺陷和卵泡發(fā)育缺陷與GDF9-/-和BMP15-/-GDF9+/-及AMHcresmad4-/-小鼠表型高度一致。推測ggps1的敲除可能影響了TGFβ家族成員的功能。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，TGFβ家族成員羧基端氨基酸序列符合異戊二烯化修飾的“CaaX”序列特征，