人包皮成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及MICA-001、-008基因在其中的表達(dá).pdf

1、MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)基因A(MHC classⅠ related chains A，MICA)是MHCⅠ類相關(guān)基因的成員，具有高度的多態(tài)性，已發(fā)現(xiàn)70多種等位基因型。MICA基因編碼的MICA蛋白是NKG2D(NK細(xì)胞主要的活化性受體之一)的重要配體。MICA基因在器官移植、腫瘤免疫、病毒感染免疫、自身免疫病等方面發(fā)揮重要作用。沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)是常見的感染性致盲及性傳播疾病的病原體，具有特殊的

2、發(fā)育周期，常造成持續(xù)感染，并在多方面影響宿主細(xì)胞的生物學(xué)行為，但其致病機制尚不完全清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MICA*001和MICA*008可能與Ct的感染免疫機制有關(guān)。有研究表明，人成纖維細(xì)胞(human fibroblasts，HF)不表達(dá)或低表達(dá)MICA，并可被Ct感染，且人包皮組織中的成纖維細(xì)胞(humanforeskin fibroblasts，HFF)較容易分離及進行原代培養(yǎng)。目前，對于MICA是否參與了Ct感染的免疫過程

3、，國內(nèi)外研究報道較少。
　　 目的:(1)分離培養(yǎng)人包皮成纖維細(xì)胞（HFF）;(2)Ct感染HFF;(3)在HFF中表達(dá)外源性MICA*001和MICA*008基因。
　　 方法:(1)采集包皮環(huán)切術(shù)后的組織，通過組織塊貼附法分離培養(yǎng)HFF。在37℃、5％CO2條件下，利用含15％FBS的DMEM培養(yǎng)基對HFF進行體外培養(yǎng)，并記錄其不同生長過程中的細(xì)胞形態(tài);(2)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法對人成纖維細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白進行檢測，初

4、步對HFF進行鑒定;(3)對原代培養(yǎng)的HFF進行細(xì)菌及支原體的檢測;(4)繪制第6代和第12代HFF的生長曲線、分析第8代HFF的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)，以確定所培養(yǎng)HFF的增殖能力及性狀的穩(wěn)定性;(5)Ct與HFF共培養(yǎng)40小時后，進行吉姆薩染色，觀察Ct包涵體的形成;(6)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLXSN、pLXSN-MICA*001和pLXSN-MICA*008轉(zhuǎn)染入PA317包裝細(xì)胞，收集上清液（分別含有相應(yīng)的完整病毒）;(7

5、)用含有完整病毒的三種上清液分別感染HFF，48小時后收集HFF總蛋白，western blot檢測MICA*001和MICA*008編碼的蛋白在HFF中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:(1)應(yīng)用組織塊貼附法成功分離出HFF，經(jīng)鑒定該細(xì)胞可以連續(xù)傳代、增殖能力較強并且性狀穩(wěn)定;(2)吉姆薩染色后HFF內(nèi)可見Ct包涵體，說明Ct可以感染HFF;(3)應(yīng)用pLXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)將MICA*001和MICA*008基因?qū)胫罤FF中;(4)w