甜菜夜蛾與棉鈴蟲內(nèi)源性piggyBac轉(zhuǎn)座子的研究.pdf

1、piggyBac轉(zhuǎn)座子是典型的DNA轉(zhuǎn)座子,最初是從粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的細(xì)胞系中分離出來(lái)的。由于該轉(zhuǎn)座子在多種昆蟲的基因組上都具有高轉(zhuǎn)座活性,因此piggyBac已經(jīng)成為一種高效的轉(zhuǎn)基因載體廣泛用于昆蟲的轉(zhuǎn)基因研究和實(shí)踐。現(xiàn)在普遍認(rèn)為,在轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因昆蟲中,內(nèi)源性同源轉(zhuǎn)座子將影響昆蟲轉(zhuǎn)基因的成功率和穩(wěn)定性。因此有必要對(duì)目標(biāo)昆蟲進(jìn)行內(nèi)源性轉(zhuǎn)座子的調(diào)查分析。由于轉(zhuǎn)座子很難用常規(guī)的RT-PCR和RACE技術(shù)進(jìn)行克

2、隆鑒定,故本研究在兼并引物PCR的基礎(chǔ)上,利用inverse PCR和vectorret PCR技術(shù),不僅調(diào)查了鱗翅目?jī)煞N重要的農(nóng)業(yè)害蟲甜菜夜蛾和棉鈴蟲的內(nèi)源piggyBac存在情況,同時(shí)克隆到了內(nèi)源性的piggyBac轉(zhuǎn)座子,并且從棉鈴蟲中獲得了一個(gè)結(jié)構(gòu)完整、具有潛在活性的piggyBac轉(zhuǎn)座子HaPLE1。 1 甜菜夜蛾piggyBac轉(zhuǎn)座子基因的克隆與序列分析 采用PCR技術(shù),利用兼并引物,從甜菜夜蛾基因組中克隆出

3、一個(gè)內(nèi)源性piggyBac類似因子的DNA片段,并命名為SePLE。該基因片段長(zhǎng)456bp,推導(dǎo)的氨基酸序列與幾種昆蟲中的piggyBac氨基酸序列的相似性迭50％-78％,但中間出現(xiàn)1個(gè)終止密碼子。根據(jù)這個(gè)片段,通過(guò)inverse PCR技術(shù),雖然克隆到兩個(gè)不同的基因拷貝(SePLE1和SePLE2),但兩個(gè)拷貝不僅都缺失了特征性的短末端重復(fù)序列,而且編碼轉(zhuǎn)座酶的開放閱讀框中也都出現(xiàn)了多個(gè)突變(終止密碼子),由此認(rèn)為,甜菜夜蛾體內(nèi)具有

4、內(nèi)源性piggyBac類似因子,但本研究所克隆的拷貝SePLE1和SePLE2已經(jīng)喪失了轉(zhuǎn)座活性。 2 棉鈴蟲piggyBac轉(zhuǎn)座子基因的克隆與序列分析 利用兼并引物PCR、inverse PCR和vectorret PCR技術(shù),從棉鈴蟲的基因組中克隆獲得了2+piggyBac類似因子基因的DNA全長(zhǎng),并分別命名為HaPLE1和HaPLE2。其中HaPLE1(GenBattk accession number:EF593

5、176)全長(zhǎng)2500bp,含有編碼597個(gè)氨基酸的1794bp開放閱讀框(ORE),具有16bp末端反向重復(fù)序列(ITR)和piggyBac轉(zhuǎn)座子家族特征性的TTAA插入序列。HaPLE1轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列與其它昆蟲piggyBac因子的相似性很高,與家蠶Bombyx mori的yabusame-1的相似性為46％,與煙芽夜蛾Heliothis virescens的HvPLE1的相似性為48％,與桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsa

6、lis的piggyBac類似因子的相似性為67％,與粉紋夜蛾T.ni的IFP2的相似性為78％。同時(shí)HaPLE1推導(dǎo)的氨基酸序列中還具有可能構(gòu)成DDD結(jié)構(gòu)域的四個(gè)天冬氨酸D268,D346,D447和D450。由此認(rèn)為HaPLE1是自主性因子,具有潛在的轉(zhuǎn)座活性。而HaPLE2全長(zhǎng)只有982bp,與HaPLE1的相似很高,并具有完全相同的ITR列和插入序列,但缺失了大部分的轉(zhuǎn)座酶編碼序列。 3 棉鈴蟲piggyBac基因旁側(cè)序列

7、的克隆 進(jìn)一步進(jìn)行TE展示研究表明,棉鈴蟲piggyBac類似因子在基因組中的拷貝數(shù)較少,在同一品系的不同個(gè)體中有不同的插入位點(diǎn)。利用vectorret PCR克隆了12個(gè)棉鈴蟲個(gè)體中piggyBac轉(zhuǎn)座子基因的旁側(cè)序列,通過(guò)測(cè)序獲得了12個(gè)5'上游旁側(cè)序列和8個(gè)3'下游旁側(cè)序列。序列分析表明,其中的11個(gè)5'上游旁側(cè)序列和7個(gè)3'下游旁側(cè)序列都屬于HaPLE2。將獲得的12個(gè)上游旁側(cè)序列和8個(gè)下游旁側(cè)序列,進(jìn)行Blast同源性

8、搜索,結(jié)果都沒有找到相應(yīng)的基因,表明piggyBac類似因子更傾向于插入基因間隔區(qū)或者基因非編碼區(qū),從而不影響基因功能或者正常表達(dá)。由此認(rèn)為,piggyBac侵入棉鈴蟲種群歷史不長(zhǎng),HaPLE1是棉鈴蟲的一個(gè)結(jié)構(gòu)完整的piggyBac類似因子,可能仍然具有轉(zhuǎn)座活性；而HaPLE2可能是由HaPLE1發(fā)生缺失和突變而來(lái)的非自主性轉(zhuǎn)座子；這些轉(zhuǎn)座子如果轉(zhuǎn)座插入功能基因區(qū),很可能產(chǎn)生致死效應(yīng)。 4 HaPLE1,HaPLE2在棉鈴蟲不

9、同地理品系的分布 在棉鈴蟲piggyBac類似因子HaPLE1和HaPLE2核苷酸序列的相同區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物,利用PCR方法調(diào)查這兩個(gè)基因在三個(gè)不同的棉鈴蟲地理種群NJ品系,GY品系以及Oxford品系中的存在情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HaPLE2因子存在于三個(gè)品系的所有被調(diào)查的棉鈴蟲個(gè)體,而HaPLE1存在于NJ品系35％的個(gè)體中,存在于GY品系35％的個(gè)體中,以及Oxford品系24％的個(gè)體中。由此我們可以得出以下兩點(diǎn)推論：第一,pi

10、ggyBac類似因子在二十年前就已經(jīng)存在于棉鈴蟲的基因組中。因?yàn)镺xford品系是二十年前采集于自然界中,之后在室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)。第二,HaPLE1可能仍具有轉(zhuǎn)座活性。因?yàn)楫?dāng)一個(gè)轉(zhuǎn)座子失去活性時(shí)就被固定在基因組上,這個(gè)基因也會(huì)由于遺傳而出現(xiàn)在下一代的基因組中,當(dāng)在室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)幾代之后,這個(gè)基因就會(huì)存在于幾乎所有的個(gè)體中,而HaPLE1只存在于24-35％的棉鈴蟲個(gè)體的基因組中。 5 piggyBac轉(zhuǎn)座子基因的親緣關(guān)系樹分析

11、 收集各種數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的來(lái)自11種生物的19個(gè)piggyBac類似因子的氨基酸序列,利用CLUSTALX1.8和MEGA3.1構(gòu)建親緣關(guān)系樹,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,雖然已有的piggyBac轉(zhuǎn)座酶大致歸為三個(gè)大的類群(CladeⅠ,CladeⅡ,CladeⅢ)。但除了CladeⅠ全為來(lái)自昆蟲的piggyBac類似因子(包括HaPLE1)外,CladeII和CladeIII中既有昆蟲的piggyBac因子又有哺乳動(dòng)物的piggyBac

12、因子,根據(jù)piggyBac因子相似性得出的物種之間的親緣關(guān)系嚴(yán)重背離了宿主之間實(shí)際的親緣關(guān)系。由此證實(shí)了piggyBac轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化的過(guò)程中并不僅僅進(jìn)行垂直遺傳,也存在水平轉(zhuǎn)移。此外,親緣關(guān)系樹研究還發(fā)現(xiàn),來(lái)自同一物種的不同轉(zhuǎn)座子,可以歸為不同的類型,表明不同類型的piggyBac可以反復(fù)感染同一種群。 6 棉鈴蟲piggyBac在果蠅卵中的轉(zhuǎn)座活性研究 將從棉鈴蟲基因組中克隆到的兩個(gè)piggyBac因子HaPLE1和H

13、aPLE2分別構(gòu)建成p3E1.2-CBW-1,p3E1.2-CBW-2兩個(gè)質(zhì)粒,通過(guò)電穿孔儀將質(zhì)粒導(dǎo)入果蠅的胚胎,隨后回收質(zhì)粒,檢測(cè)棉鈴蟲的2個(gè)piggyBac轉(zhuǎn)座子在果蠅中的轉(zhuǎn)座活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HaPLE2構(gòu)建的質(zhì)粒在果蠅卵中沒有剪切發(fā)生,但HaPLE1構(gòu)建的質(zhì)粒具有0.00025％的剪切頻率,不過(guò)觀察到的剪切位點(diǎn)均不是piggyBac轉(zhuǎn)座子的經(jīng)典剪切位點(diǎn)TTAA。由此認(rèn)為,棉鈴蟲基因組中克隆到的piggyBac因子HaPLE1可能具有