13928.piggybac轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建與在牛成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)座位點(diǎn)的分析

1、分類號(hào)Q812UDC576學(xué)校代碼10129學(xué)號(hào)2010211010PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建與在牛成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)座位點(diǎn)的分析PiggyBacTransposonConstructionInBovineFibroblastCellsTranspositionSeatAnalysis申請(qǐng)人：白宏偉學(xué)科門類：理學(xué)學(xué)科專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)研究方向：動(dòng)物遺傳與發(fā)育指導(dǎo)教師：周歡敏教授論文提交日期：二○一三年六月摘要本研究利用piggybac轉(zhuǎn)

2、座子為載體將嗜熱菌糖苷酶(LacS)基因整合到牛成纖維細(xì)胞的基因組中，并分析了piggybac轉(zhuǎn)座子在牛成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座效率和轉(zhuǎn)座位點(diǎn)的特性。同時(shí)，在研究中探討了轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶二元載體轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞時(shí)的最佳比例。1從Puc57載體上克隆的LacS和BLG表達(dá)框與從pZGL載體上克隆到的ZGL表達(dá)框相連，并且擴(kuò)增ZGL表達(dá)框時(shí)設(shè)計(jì)的上游引物中引入NotⅠ、AflⅡ、NheⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入SalⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，兩個(gè)表達(dá)框

3、經(jīng)酶切連接后得到質(zhì)粒pZGLLacS，測(cè)序鑒定。2通過PCR從pLOXEGFP上克隆PGKNEO片段，并在設(shè)計(jì)引物時(shí)在上游引物5’端引入NheⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物3’端加2A和BamHⅠ，然后用NheI，BamHI酶切將得到的片段連接到pEGPFN1載體中，新構(gòu)建的質(zhì)粒記為pEGFPNEON1，再?gòu)拇速|(zhì)粒上克隆PGKNEOEGFP表達(dá)框，然后用NheⅠ和AflⅡ雙酶切，連接到已經(jīng)構(gòu)建好的載體pZGLLacS中，測(cè)序鑒定。3將轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座

4、酶載體以5：1的比例轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分別以1：301:601:100三個(gè)梯度稀釋傳代，篩選單克隆細(xì)胞，培養(yǎng)液內(nèi)G418的濃度為600ugml。在這三種不同的稀釋濃度下分析添加和不添加轉(zhuǎn)座酶對(duì)細(xì)胞單克隆形成的影響?？捡R斯亮藍(lán)染色后得到的結(jié)果為不添加轉(zhuǎn)座酶的的組沒有能形成單克隆，與添加了轉(zhuǎn)座酶的組差別極顯著。4為了找到轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶的最佳比例，將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座酶的比例梯度設(shè)為10:15:12:11:21:51:10，細(xì)胞傳代比