PB轉座子介導的雙干擾載體及卵巢特異性表達載體的構建及其效果的研究.pdf

1、水牛是南方的重要品種資源，具有較強抗病抗逆耐粗的能力，而且水牛奶具有高蛋白高乳脂率的特征，將是南方鮮奶和高端奶的重要來源。我國政府大力支持在南方養(yǎng)殖奶水牛，然而水牛的繁殖性能較低，是水牛業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。抑制素(Inhibin，INH)、卵泡抑素(Follistatin，FST)對促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，FSH)具有反饋調控作用，從而在一定程度上影響卵巢功能及卵泡發(fā)育。目前已開展了許多有關IN

2、H或FST單個基因免疫和提高動物繁殖力的研究，并取得了較好的效果：利用轉基因和RNAi技術同時抑制INH和FST表達是否可以調控水牛卵巢功能和卵泡發(fā)育及提高繁殖性能，以及提高FSHp表達水平對生殖生理和繁殖性能的影響，這方面報道還不多。PiggyBac轉座子(PB)是一種DNA轉座子，已作為基因轉移和插入誘變等基因研究的有效工具，廣泛應用于哺乳動物基因功能和轉基因的研究。本研究利用PB轉座系統，構建了同時干擾INHA和FST的雙干擾載體

3、，在細胞水平分析表達和干擾效率、篩選穩(wěn)定整合的陽性細胞；構建含有水牛卵巢特異性啟動子的FSHβ表達載體，分析其特異表達特性和表達效率。為水?；蚬δ堋⒙殉补δ芎吐雅莅l(fā)育調控機理及轉基因技術打下基礎。
　　 本研究的主要結果如下：
　　 (1)針對INHA和FST基因序列設計RNAi干擾片段，構建了含有兩個轉錄元件的雙干擾載體pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2。
　　 (2)比較分析了雙干擾載體的瞬時轉染

4、和與PB轉座酶共轉染的轉染效率。分別利用瞬時轉染和共轉染方法轉染水牛卵巢顆粒細胞(Buffalo fetal fibroblast cells，BuGCs)和水牛胎兒成纖維細胞(Buffalo fetal fibroblast cells，BuFFs)，分別統計轉染第24h、48h和72h時載體中綠色熒光蛋白(GFP)在細胞中綠色熒光表達量。在轉染24h時瞬時轉染的細胞轉染率高于共轉染，而在其它時間共轉染的轉染效率均高于瞬時轉染。

5、>　　 (3)證明了雙干擾載體pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2對INHA和FST基因具有一定的抑制效果。通過Q-PCR檢測，細胞內INHA和FST的mRNA的表達均因RNAi而有所減少，其中INHA在共轉染BuGCs時被干擾程度最大(37.37%)，其表達量顯著地低于空白對照組；在瞬時轉染黃牛卵巢顆粒細胞(Bovine granulosa cells，BGCs)中FST干擾率為3.55%。
　　 (4)篩選出了IN

6、HA和FST基因RNAi片段穩(wěn)定整合到基因組的陽性細胞。經G418篩選轉染細胞，觀察熒光表達情況，轉染第7天后BuGCs和BuFFs熒光表達基本穩(wěn)定，并且通過PCR鑒定轉染后細胞基因組含有PB轉座子的序列。
　　 (5)構建了分別含卵巢特異性啟動子CYP19、OSP-1(廣西大學惠贈)的pB-CYP19和pB-OSP1表達載體；
　　 (6)構建了水牛FSHβ全長cDNA的卵巢特異表達的pB-CYP19-FSHβ和pB-

7、OSP1-FSHβ載體；
　　 (7)證明了兩個表達載體具有卵巢特異表達的特性，pB-OSP1-FSHβ載體超表達效率較高。將兩個載體分別轉染BuGCs和BuFFs，利用RT-PCR技術檢測出了BuGCs的FSHβ表達，而在BuFFs中卻沒有表達，證明了這兩個載體具有水牛卵巢特異表達特性；而且pB-OSP1-FSHβ載體的FSHβ表達效率(13.04%)高于pB-CYP19-FSHβ載體(1.2%)，故pB-OSP1-FSHβ載