異氟烷對(duì)老年大鼠海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的影響.pdf

1、目的及意義： 近來研究發(fā)現(xiàn)異氟烷等麻醉手術(shù)后，老年人認(rèn)知功能易發(fā)生改變，歸納為術(shù)后譫妄(post-operative delirium，PD)和術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitivedysfunction，POCD)。PD常發(fā)生于術(shù)后1～3天，POCD常發(fā)生于術(shù)后1周內(nèi)，有研究認(rèn)為術(shù)后2～5天最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為精神錯(cuò)亂、焦慮、人格的改變及記憶受損等，PD和POCD在嚴(yán)重的情況下都可發(fā)展為老年性癡呆，其機(jī)制

2、尚不清楚，目前認(rèn)為老齡是危險(xiǎn)因素。研究表明中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，作為該系統(tǒng)的標(biāo)志酶.膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)的活性降低是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因，并且大量的研究也證實(shí)了乙酰膽堿能傳遞系統(tǒng)可能是許多全身麻醉藥的重要靶區(qū)。因而推測(cè)老年術(shù)后認(rèn)知功能發(fā)生改變的機(jī)制可能與麻醉藥抑制中樞膽堿能系統(tǒng)和中樞膽堿能系統(tǒng)功能隨老齡化衰退有關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Moms水迷宮檢測(cè)異氟烷麻醉后第2，3天老年、青年大鼠空間記憶并應(yīng)用Western

3、和熒光定量PCR方法檢測(cè)海馬區(qū)CHAT蛋白含量及mRNA表達(dá)的改變，探討異氟烷對(duì)老年術(shù)后認(rèn)知功能改變機(jī)制。 材料與方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要材料 選用健康雌性SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，老年組14月齡、體重400～420g:青年組3月齡、體重190～210g。Morris水迷宮(Stoelting Company.U.S.A.)，Dager Fabius麻醉機(jī)(德國(guó))，HYUNDA麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀，異

4、氟烷(上海雅培)，RNAsimpleTotal RNA Kit(天根生化科技有限公司)，RT-PCR Kit(TOYOBO公司)， PCR擴(kuò)增引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，SYBR定量PCR試劑盒(TOYOBO公司)，2000bp DNA Ladder Marker天根生化科技有限公司，DEPC(美國(guó)Sigma公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，第一抗體：抗Rat-CHAT(SANTA CRUZ公司)，羊(Goat)

5、抗-GAPDH單克隆抗體(SANTA CRUZ公司)，第二抗體：辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山兔抗羊IgG(H+L)(北京中杉會(huì)橋公司)，ABIPrism7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)， PCR System9700擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)核酸蛋白分析儀(德國(guó)Beckman Coupe公司)，轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠)，美國(guó)Bio-Rad酶標(biāo)儀、美國(guó)Bio-Rad電泳槽(M

6、INI PROTEAN IITM)、美圍Bio-Rad電泳儀(3000XI)、美國(guó)Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)等。 2.方法： 2.1 Morris水迷宮檢測(cè)異氟烷麻醉后第2，3天對(duì)老年、青年大鼠空間記憶影響 2.1.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)程序： ①定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation test，PNT):實(shí)驗(yàn)前一天下午將大鼠放入水迷宮中自由游泳2min以熟悉環(huán)境。實(shí)驗(yàn)分二階段：第一階段，

7、大鼠異氟烷麻醉前開始，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4天半，每天在固定時(shí)間分上、下午兩個(gè)時(shí)間段進(jìn)行，共10個(gè)時(shí)間段，每時(shí)間段訓(xùn)練4次。平臺(tái)置于2象限，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別從四個(gè)象限的池壁中點(diǎn)，將大鼠面壁輕放入水中，每時(shí)間段4次隨機(jī)從不同象限入水。大鼠在水中游泳一段時(shí)間后爬上站臺(tái)，并在平臺(tái)停留5s，則認(rèn)為找到站臺(tái)如果在120s內(nèi)未找到站臺(tái)，則由試驗(yàn)者將其引上站臺(tái)并停留20s，潛伏期記為120s。第二階段在異氟烷麻醉后第2，3天進(jìn)行測(cè)試。圖像采集系統(tǒng)及分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄保存

8、大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，找到平臺(tái)的潛伏期、游泳時(shí)間、游泳速度、游泳距離及尋找站臺(tái)的搜尋策略等信息。 ②空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test，SPT):完成定位航行實(shí)驗(yàn)后撤離平臺(tái)，選定與平臺(tái)象限相對(duì)的象限的中點(diǎn)為入水點(diǎn)，記錄大鼠搜尋平臺(tái)的搜尋測(cè)略，平臺(tái)象限游泳距離與總距離之比。 2.1.2老年和青年大鼠異氟烷吸入全身麻醉 老年、青年大鼠隨機(jī)分為異氟烷麻醉組(n=16 aged and16young)和對(duì)照組(

9、n=12aged and12young)。麻醉組給予1.2％異氟烷麻醉2小時(shí)，并監(jiān)測(cè)異氟烷氣體的濃度及大鼠的平均動(dòng)脈壓、心率、脈搏氧飽和度、血?dú)獾壬w征，麻醉后使其自然蘇醒。麻醉結(jié)束后將各組動(dòng)物分為兩部分，一部分麻醉后第2，3天斷頭處死取出海馬組織，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測(cè)老、青年大鼠CHAT在海馬區(qū)蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，另一部分應(yīng)用Morris水迷宮檢測(cè)麻醉后第2，3天空間記憶能力。 2.2.異氟

10、烷對(duì)老、青年大鼠海馬區(qū)CHAT的影響 異氟烷麻醉后第2，3天分別斷頭處死每組大鼠取出海馬組織，PBS漂洗后平均分成2份，-80度保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western方法分別檢測(cè)老、青年大鼠CHAT在海馬區(qū)蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。 2.2.1實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)老、青年大鼠海馬區(qū)CHATmRNA相對(duì)表達(dá)量。 方法：取海馬組織進(jìn)行總RNA提取，步驟依循RNAsimple Total RNA Kit操作說明，以26

11、0nm及280nm吸光度計(jì)算所獲RNA含量及純度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成，終產(chǎn)物于-20℃保存。引物設(shè)計(jì)：對(duì)GAPDH和CHAT基因序列blast進(jìn)行特異性分析，用Primer5設(shè)計(jì)引物。CHAT上游引物：5'-GCCCGAGACCTGTGCAAAGA-3'，下游引物：5'-CCACAGCTTCCGCAAACTCC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度248bp。GAPDH上游引物：5'-ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3'，下游引物：5'-

12、GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物159bp。兩對(duì)引物由上海生物工程有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀對(duì)對(duì)照組和異氟烷麻醉組海馬區(qū)CHAT的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)并做熔解曲線檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。 2.2.2 Western檢測(cè)老、青年大鼠海馬區(qū)CHAT蛋白表達(dá)水平。 方法：取海馬組織在液氮中研磨至成微末于裂解液中機(jī)械勻漿，離心(4℃，12000r/min)，15 min。BCA

13、法測(cè)蛋白濃度，-70℃凍存。制備10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠，樣品100℃變性后每孔加等量(50ug)蛋白樣品，電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5％脫脂奶粉TBS緩沖液室溫震蕩封閉2h后洗膜，TBST洗3次，每次10min。孵育一抗，4℃，搖床過夜。轉(zhuǎn)至室溫?fù)u置約30min，以恢復(fù)室溫。洗膜3次，每次10min，加二抗辣根過氧，封袋，搖置2h，沈膜3次，每次lOmin。按1:1配制A、B發(fā)光液，用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，并分

14、析條帶的光密度，計(jì)算兩個(gè)處理組CHAT與GAPDH光密度的比值，通過比值判斷CHAT蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果分析： 1.Morris水迷宮檢測(cè)異氟烷麻醉后第2，3天老年、青年大鼠空間記憶 異氟烷麻醉后第2，3天與對(duì)照組相比老、青年麻醉組潛伏期增高，記憶測(cè)試平臺(tái)象限路徑與總路徑比值降低，老年組麻醉組改變更為顯著((P<0.05)。老、青年麻醉組在1.2％異氟烷麻醉2小時(shí)中生命體征均維持平穩(wěn)，沒有低血壓、呼吸抑制和缺氧

15、征象出現(xiàn)。 2.海馬區(qū)CHAT mRNA的表達(dá)水平 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，GAPDH和CHAT的熔解曲線均呈尖銳的單一峰，說明CHAT和GAPDH基因的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較強(qiáng)。異氟烷麻醉后第2天：海馬區(qū)CHATmRNA相對(duì)表達(dá)量老年麻醉組較對(duì)照組減少76.9％，青年麻醉組較對(duì)照組減少46.6％。麻醉后第3天：海馬區(qū)CHATmRNA表達(dá)量老年麻醉組較對(duì)照組減少57.7％，青年異氟烷麻醉組較對(duì)照組減少46.8％。由此可見，異氟

16、烷麻醉后老、青年海馬區(qū)CHATmRNA表達(dá)水平都下降；與青年相比老年CHATmRNA降低更為顯著。 3.CHAT蛋白表達(dá)水平的變化 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比麻醉后老年和青年大鼠海馬區(qū)CHAT蛋白表達(dá)均降低；其中老年組有顯著差異((P<0.05)。 結(jié)論： 異氟烷麻醉后第2，3天，老年和青年大鼠空間記憶能力、海馬區(qū)CHAT的表達(dá)與對(duì)照組相比都有所降低，老年組降低更為顯著。 結(jié)