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文檔簡介
1、目的及意義: 近來研究發(fā)現(xiàn)異氟烷等麻醉手術(shù)后,老年人認知功能易發(fā)生改變,歸納為術(shù)后譫妄(post-operative delirium,PD)和術(shù)后認知功能障礙(postoperative cognitivedysfunction,POCD)。PD常發(fā)生于術(shù)后1~3天,POCD常發(fā)生于術(shù)后1周內(nèi),有研究認為術(shù)后2~5天最為嚴(yán)重,表現(xiàn)為精神錯亂、焦慮、人格的改變及記憶受損等,PD和POCD在嚴(yán)重的情況下都可發(fā)展為老年性癡呆,其機制
2、尚不清楚,目前認為老齡是危險因素。研究表明中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān),作為該系統(tǒng)的標(biāo)志酶.膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)的活性降低是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因,并且大量的研究也證實了乙酰膽堿能傳遞系統(tǒng)可能是許多全身麻醉藥的重要靶區(qū)。因而推測老年術(shù)后認知功能發(fā)生改變的機制可能與麻醉藥抑制中樞膽堿能系統(tǒng)和中樞膽堿能系統(tǒng)功能隨老齡化衰退有關(guān)。因此本實驗應(yīng)用Moms水迷宮檢測異氟烷麻醉后第2,3天老年、青年大鼠空間記憶并應(yīng)用Western
3、和熒光定量PCR方法檢測海馬區(qū)CHAT蛋白含量及mRNA表達的改變,探討異氟烷對老年術(shù)后認知功能改變機制。 材料與方法: 1.實驗動物和主要材料 選用健康雌性SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供),老年組14月齡、體重400~420g:青年組3月齡、體重190~210g。Morris水迷宮(Stoelting Company.U.S.A.),Dager Fabius麻醉機(德國),HYUNDA麻醉氣體監(jiān)測儀,異
4、氟烷(上海雅培),RNAsimpleTotal RNA Kit(天根生化科技有限公司),RT-PCR Kit(TOYOBO公司), PCR擴增引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),SYBR定量PCR試劑盒(TOYOBO公司),2000bp DNA Ladder Marker天根生化科技有限公司,DEPC(美國Sigma公司),瓊脂糖(西班牙Biowest公司),第一抗體:抗Rat-CHAT(SANTA CRUZ公司),羊(Goat)
5、抗-GAPDH單克隆抗體(SANTA CRUZ公司),第二抗體:辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)(北京中杉金橋公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記山兔抗羊IgG(H+L)(北京中杉會橋公司),ABIPrism7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司), PCR System9700擴增儀(美國ABI公司)核酸蛋白分析儀(德國Beckman Coupe公司),轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠),美國Bio-Rad酶標(biāo)儀、美國Bio-Rad電泳槽(M
6、INI PROTEAN IITM)、美圍Bio-Rad電泳儀(3000XI)、美國Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)等。 2.方法: 2.1 Morris水迷宮檢測異氟烷麻醉后第2,3天對老年、青年大鼠空間記憶影響 2.1.1 Morris水迷宮實驗程序: ①定位航行實驗(place navigation test,PNT):實驗前一天下午將大鼠放入水迷宮中自由游泳2min以熟悉環(huán)境。實驗分二階段:第一階段,
7、大鼠異氟烷麻醉前開始,實驗歷時4天半,每天在固定時間分上、下午兩個時間段進行,共10個時間段,每時間段訓(xùn)練4次。平臺置于2象限,實驗時分別從四個象限的池壁中點,將大鼠面壁輕放入水中,每時間段4次隨機從不同象限入水。大鼠在水中游泳一段時間后爬上站臺,并在平臺停留5s,則認為找到站臺如果在120s內(nèi)未找到站臺,則由試驗者將其引上站臺并停留20s,潛伏期記為120s。第二階段在異氟烷麻醉后第2,3天進行測試。圖像采集系統(tǒng)及分析系統(tǒng)自動記錄保存
8、大鼠的運動軌跡,找到平臺的潛伏期、游泳時間、游泳速度、游泳距離及尋找站臺的搜尋策略等信息。 ②空間探索實驗(spatial probe test,SPT):完成定位航行實驗后撤離平臺,選定與平臺象限相對的象限的中點為入水點,記錄大鼠搜尋平臺的搜尋測略,平臺象限游泳距離與總距離之比。 2.1.2老年和青年大鼠異氟烷吸入全身麻醉 老年、青年大鼠隨機分為異氟烷麻醉組(n=16 aged and16young)和對照組(
9、n=12aged and12young)。麻醉組給予1.2%異氟烷麻醉2小時,并監(jiān)測異氟烷氣體的濃度及大鼠的平均動脈壓、心率、脈搏氧飽和度、血氣等生命體征,麻醉后使其自然蘇醒。麻醉結(jié)束后將各組動物分為兩部分,一部分麻醉后第2,3天斷頭處死取出海馬組織,采用實時定量PCR和Western blot方法檢測老、青年大鼠CHAT在海馬區(qū)蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的表達,另一部分應(yīng)用Morris水迷宮檢測麻醉后第2,3天空間記憶能力。 2.2.異氟
10、烷對老、青年大鼠海馬區(qū)CHAT的影響 異氟烷麻醉后第2,3天分別斷頭處死每組大鼠取出海馬組織,PBS漂洗后平均分成2份,-80度保存。采用實時熒光定量PCR和Western方法分別檢測老、青年大鼠CHAT在海馬區(qū)蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的表達。 2.2.1實時定量PCR檢測老、青年大鼠海馬區(qū)CHATmRNA相對表達量。 方法:取海馬組織進行總RNA提取,步驟依循RNAsimple Total RNA Kit操作說明,以26
11、0nm及280nm吸光度計算所獲RNA含量及純度,逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成,終產(chǎn)物于-20℃保存。引物設(shè)計:對GAPDH和CHAT基因序列blast進行特異性分析,用Primer5設(shè)計引物。CHAT上游引物:5'-GCCCGAGACCTGTGCAAAGA-3',下游引物:5'-CCACAGCTTCCGCAAACTCC-3',產(chǎn)物長度248bp。GAPDH上游引物:5'-ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3',下游引物:5'-
12、GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3',擴增產(chǎn)物159bp。兩對引物由上海生物工程有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參,采用實時熒光PCR擴增儀對對照組和異氟烷麻醉組海馬區(qū)CHAT的相對表達量進行檢測并做熔解曲線檢測擴增產(chǎn)物的特異性。 2.2.2 Western檢測老、青年大鼠海馬區(qū)CHAT蛋白表達水平。 方法:取海馬組織在液氮中研磨至成微末于裂解液中機械勻漿,離心(4℃,12000r/min),15 min。BCA
13、法測蛋白濃度,-70℃凍存。制備10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠,樣品100℃變性后每孔加等量(50ug)蛋白樣品,電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉TBS緩沖液室溫震蕩封閉2h后洗膜,TBST洗3次,每次10min。孵育一抗,4℃,搖床過夜。轉(zhuǎn)至室溫搖置約30min,以恢復(fù)室溫。洗膜3次,每次10min,加二抗辣根過氧,封袋,搖置2h,沈膜3次,每次lOmin。按1:1配制A、B發(fā)光液,用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像,并分
14、析條帶的光密度,計算兩個處理組CHAT與GAPDH光密度的比值,通過比值判斷CHAT蛋白的表達變化。 結(jié)果分析: 1.Morris水迷宮檢測異氟烷麻醉后第2,3天老年、青年大鼠空間記憶 異氟烷麻醉后第2,3天與對照組相比老、青年麻醉組潛伏期增高,記憶測試平臺象限路徑與總路徑比值降低,老年組麻醉組改變更為顯著((P<0.05)。老、青年麻醉組在1.2%異氟烷麻醉2小時中生命體征均維持平穩(wěn),沒有低血壓、呼吸抑制和缺氧
15、征象出現(xiàn)。 2.海馬區(qū)CHAT mRNA的表達水平 實時熒光定量PCR結(jié)果,GAPDH和CHAT的熔解曲線均呈尖銳的單一峰,說明CHAT和GAPDH基因的擴增產(chǎn)物特異性較強。異氟烷麻醉后第2天:海馬區(qū)CHATmRNA相對表達量老年麻醉組較對照組減少76.9%,青年麻醉組較對照組減少46.6%。麻醉后第3天:海馬區(qū)CHATmRNA表達量老年麻醉組較對照組減少57.7%,青年異氟烷麻醉組較對照組減少46.8%。由此可見,異氟
16、烷麻醉后老、青年海馬區(qū)CHATmRNA表達水平都下降;與青年相比老年CHATmRNA降低更為顯著。 3.CHAT蛋白表達水平的變化 Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比麻醉后老年和青年大鼠海馬區(qū)CHAT蛋白表達均降低;其中老年組有顯著差異((P<0.05)。 結(jié)論: 異氟烷麻醉后第2,3天,老年和青年大鼠空間記憶能力、海馬區(qū)CHAT的表達與對照組相比都有所降低,老年組降低更為顯著。 結(jié)
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