七氟烷與異氟烷對糖尿病大鼠空間學(xué)習記憶影響的比較及其分子機制研究.pdf

1、Bedford于1955年首次報道了全身麻醉術(shù)后老年患者出現(xiàn)癡呆，建議“老年患者實行全身麻醉應(yīng)有明確的適應(yīng)證”。之后研究證實麻醉手術(shù)可引起術(shù)后認知功能障礙(POCD)的發(fā)生，尤其是術(shù)后早期。POCD屬輕微的神經(jīng)認知功能紊亂，表現(xiàn)為麻醉手術(shù)后記憶力、抽象思維及定向力障礙，同時伴有社會活動能力的減退，即人格、社交能力及認知能力和技巧的下降。POCD一旦發(fā)生可致并發(fā)癥增多、康復(fù)延遲、醫(yī)療費用增加甚至病死率增高等。
　　POCD發(fā)病機制尚

2、不明確。有研究證實，POCD常是多因素協(xié)同作用的結(jié)果。其易發(fā)因素有高齡、合并基礎(chǔ)疾?。ㄌ悄虿　⒏哐獕?、冠心病、癲癇等）以及長期服用某些藥物等。促發(fā)因素包括應(yīng)激反應(yīng)、手術(shù)麻醉、圍術(shù)期低血壓、低氧血癥、腦血流減低及酸堿平衡紊亂等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，POCD可能與乙酰膽堿含量減少，S100β蛋白表達增高，tau蛋白過度磷酸化，β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積增加或中樞炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　隨著生活水平提高，糖尿病已是臨床上常見的慢性病之一，且其發(fā)病

3、率呈逐年上升的趨勢。2013年Xu等在JAMA研究指出:中國成年人有近12％患有糖尿病，且前驅(qū)糖尿病的患病率大約為50％。糖尿病本身所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是近年來關(guān)注的新領(lǐng)域，其具體表現(xiàn)是輕度認知功能損害(MCI)的發(fā)生，臨床癥狀以學(xué)習和記憶能力下降為主。糖尿病可能由于高血糖對腦血管和腦組織的直接損害作用，胰島素的絕對不足或相對缺乏改變海馬突觸間的可塑性，胰島素抵抗所致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變，或由于神經(jīng)元線粒體功能紊亂進而引發(fā)糖尿病腦

4、病。隨著糖尿病的深入研究，表明炎癥在糖尿病的發(fā)生及發(fā)展過程中有不可低估的致病作用，且與胰島素抵抗有緊密聯(lián)系。因POCD與糖尿病腦病的發(fā)生與發(fā)展均有炎癥機制的參與，故本實驗從中樞炎癥的角度出發(fā)將二者聯(lián)系起來并進行相關(guān)機制的探討。
　　七氟烷和異氟烷是臨床上常用的吸入麻醉藥。多年來人們一直認為麻醉藥的效應(yīng)隨其藥理作用消退而消失，一旦藥物消除，靶器官將恢復(fù)到以前的狀態(tài)。但越來越多的證據(jù)表明并非如此。麻醉藥的神經(jīng)毒性在人類還沒有確切證據(jù)，

5、但在動物和體外實驗方面有很多數(shù)據(jù)支持。有研究顯示轉(zhuǎn)基因AD小鼠暴露于1.5MAC異氟烷2小時可能會引起tau蛋白過度磷酸化甚至神經(jīng)元細胞凋亡。最新研究顯示高濃度(1.4％～2％)異氟烷暴露2小時增強，而低濃度(0.5％～0.7％)異氟烷暴露30分鐘減弱Aβ誘導(dǎo)的細胞毒性。七氟烷與異氟烷相比是否影響實驗動物認知功能以及在影響程度和持續(xù)時間方面的研究尚無定論。
　　相反，目前吸入麻醉藥的預(yù)處理或后處理在神經(jīng)保護功能方面的研究也是熱點之

6、一，其保護功能可能是通過在過度刺激導(dǎo)致?lián)p傷前或后給予一個相對弱的刺激（例如0.5～1MAC七氟烷或異氟烷干預(yù)10～60分鐘）激發(fā)內(nèi)源性保護反應(yīng)實現(xiàn)的。所以可以認為麻醉藥保護作用與損傷作用之間是一種平衡，取決于其暴露濃度和時間以及大腦的易損傷性等?？傊肼樽硭幵趯嶒瀯游矬w上發(fā)生的毒性反應(yīng)離不開一定的條件。
　　需要接受手術(shù)麻醉的患者中合并糖尿病的人群逐年增加，這個群體可能因疾病本身加之手術(shù)麻醉等外界因素應(yīng)激后更易誘發(fā)或加重精神神經(jīng)

7、功能紊亂。
　　目的：
　　本實驗旨在比較1.5MAC七氟烷或異氟烷吸入干預(yù)2小時對糖尿病大鼠空間學(xué)習記憶的影響，并探討其可能的分子機制。
　　材料與方法：
　　SPF級雄性成年SD大鼠，體重200～260g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱重分組。糖尿病組（D組）大鼠給予腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)53mg/kg，造模成功后2周吸入30％氧氣記為糖尿病對照組(DC);吸入3.4％七氟烷(約1.5MAC)干預(yù)2h后第1天和第

8、3天行Morris水迷宮測試分別記為糖尿病吸入七氟烷后1天組(DS1)和3天組(DS3);吸入2.3％異氟烷(約1.SMAC)干預(yù)2h后第1天和第3天行水迷宮測試分別記為糖尿病吸入異氟烷后1天組(DI1)和3天組(DI3)。非糖尿病組（N組）大鼠給予腹腔內(nèi)注射檸檬酸鈉緩沖液，非糖尿病對照組(NC)、非糖尿病吸入七氟烷后1天組(NS1)和3天組(NS3)、非糖尿病吸入異氟烷后1天組(NI1)和3天組(NI3)干預(yù)方法同糖尿病組。
　

9、　各組大鼠在吸入干預(yù)前六天進行Morris水迷宮定位航行訓(xùn)練;在第7天行吸入麻醉干預(yù)，干預(yù)后第1、3天分別進行測試:先行水迷宮定位航行實驗測試，記錄大鼠尋找到平臺時間即逃逸潛伏期;之后行反轉(zhuǎn)空間探索實驗，即將平臺放在對側(cè)的象限，記錄大鼠入水后找到遷移后平臺的潛伏期，在原平臺有效區(qū)逗留時間和穿越原平臺位置次數(shù)。水迷宮測試結(jié)束后每組1/2大鼠立即斷頭處死，分離取出海馬后立即放入液氮中冷卻后轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱內(nèi)留作ELISA和熒光定量PCR檢

10、測;剩余1/2大鼠在體灌注4％多聚甲醛后斷頭、分離腦組織并將其置于4％多聚甲醛固定液中留作免疫組織化學(xué)染色。
　　熒光定量PCR法檢測大鼠海馬區(qū)促炎因子IL-1β和TNF-α以及RAGE的基因表達;ELISA法檢測大鼠海馬區(qū)Aβ1-40和p38MAPK的濃度;免疫組織化學(xué)染色評價TNF-α、NF-κBp65和RAGE蛋白表達。
　　采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示。組間比較采用單因素

11、方差分析及LSD法多重檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、大鼠體重及血糖變化
　　非糖尿病大鼠2周內(nèi)體重逐漸增加，而糖尿病大鼠體重增加不明顯或逐漸降低。STZ誘導(dǎo)后3天、1周及2周大鼠血糖均≥16.7mmol/L，明顯高于非糖尿病組(P＜0.01)。
　　二、大鼠空間學(xué)習記憶能力的評價——Morris水迷宮成績
　　1、大鼠吸入干預(yù)前六天水迷宮訓(xùn)練逃逸潛伏期和游泳速度
　　(1

12、)N組和D組大鼠水迷宮定位航行實驗逃逸潛伏期從訓(xùn)練第一天到訓(xùn)練第六天均逐漸下降且組間無差異，表明兩組大鼠定位航行實驗訓(xùn)練成功且趨勢無明顯差異(P＞0.05)。
　　(2)N組和D組大鼠六天水迷宮訓(xùn)練游泳速度均在18～20cm/s，組內(nèi)六天及組間比較均無差異(P＞0.05);排除了由于游泳速度影響測試成績的可能。
　　2、大鼠Morris水迷宮定位航行測試逃逸潛伏期
　　DI1組測試逃逸潛伏期與DC組比較明顯增加(P＜0

13、.01);DS1組與DC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);DI1組逃逸潛伏期較DS1組明顯增加(P＜0.05);DI3，DS3組大鼠逃逸潛伏期與DC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);DI1組逃逸潛伏期較NI1組明顯延長(P＜0.01)。
　　3、反轉(zhuǎn)空間探索實驗原平臺有效區(qū)逗留時間和穿越原平臺位置次數(shù)
　　(1) DI1組逗留時間與DC組比較顯著減少(P＜0.01);DI1組逗留時間與DS1組比較明顯減小(P＜0

14、.05);DI1組大鼠在原平臺有效區(qū)逗留時間與NI1組比較明顯縮短(P＜0.01)。
　　(2)各組大鼠吸入干預(yù)后反轉(zhuǎn)空間探索實驗穿越原平臺位置次數(shù)實驗結(jié)果與在原平臺有效區(qū)逗留時間一致。
　　4、反轉(zhuǎn)空間探索實驗找到遷移后平臺潛伏期
　　各組大鼠吸入干預(yù)后反轉(zhuǎn)空間探索實驗找到遷移后平臺潛伏期實驗結(jié)果與定位航行實驗測試時逃逸潛伏期結(jié)果一致。
　　三、大鼠海馬Aβ1-40濃度變化
　　大鼠吸入異氟烷或七氟烷后海

15、馬Aβ1-40濃度均升高(P＜0.01)，且異氟烷組較七氟烷組Aβ1-40濃度增加更顯著（P＜0.01）;吸入干預(yù)后第三天組海馬區(qū)Aβ1-40濃度較吸入干預(yù)后第一天組分別呈下降趨勢(P＜0.01)。
　　四、大鼠海馬RAGE表達變化
　　1、各組大鼠海馬RAGE基因表達變化
　　DC組RAGE mRNA與NC組比較表達增加(P＜0.01);DS1、DI1、DS3和DI3組RAGE mRNA與DC組比較表達均明顯增加（P

16、＜0.01）;DI1較DS1，DI3較DS3其基因表達增加更明顯（P＜0.01）;相同吸入干預(yù)下糖尿病組較非糖尿病組表達增高更加顯著（P＜0.01）。
　　2、各組大鼠海馬RAGE蛋白表達變化免疫組化染色顯示:相同吸入麻醉干預(yù)下糖尿病組大鼠RAGE蛋白表達均強于非糖尿病組;DS1、DI1、DS3和DI3組RAGE蛋白表達均強于DC組;且DI1組較DS1組、DI3組較DS3組RAGE蛋白表達強。各組大鼠海馬區(qū)RAGE蛋白表達與其基因

17、表達變化一致。
　　五、大鼠海馬p38MAPK濃度變化
　　各組大鼠海馬p38MAPK ELISA檢測濃度與海馬Aβ1-40結(jié)果趨勢一致。
　　六、大鼠海馬NF-κ Bp65蛋白表達變化
　　免疫組化染色顯示:NS1、NI1、NS3和NI3組海馬NF-κBp65蛋白表達均強于NC組;DS1、DI1、DS3和DI3組海馬NF-κ Bp65蛋白表達均強于DC組;且DI1組較DS1組、DI3組較DS3組NF-κ Bp6

18、5蛋白表達強;相同吸入麻醉干預(yù)下糖尿病組大鼠海馬NF-κBp65蛋白表達均強于非糖尿病組;吸入干預(yù)后第三天組海馬NF-κBp65蛋白表達較干預(yù)后第一天組分別呈減弱趨勢。
　　七、大鼠海馬促炎因子IL-1β和TNF-α表達變化
　　1、各組大鼠海馬促炎因子IL-1β和TNF-α基因表達變化
　　NS1、NI1、NS3和NI3組海馬促炎因子IL-1β和TNF-α mRNA與NC組比較均增加（P＜0.01）;DS1、DI1、

19、DS3和DI3組IL-1β和TNF-α mRNA與DC組比較表達均明顯增加(P＜0.01);且DI1組較DS1組、DI3組較DS3組兩促炎因子基因表達增加更顯著（P＜0.01）;在相同吸入干預(yù)下糖尿病組較非糖尿病組基因表達增高更顯著（P＜0.01）;吸入干預(yù)后第三天組海馬促炎因子基因表達較吸入干預(yù)后第一天組分別呈下降趨勢(P＜0.01)。
　　2、大鼠海馬TNF-α.蛋白表達變化
　　免疫組化顯示: DI1較DS1組、DI3

20、較DS3組TNF-α蛋白表達強;相同吸入麻醉干預(yù)下D組TNF-α蛋白表達均強于N組;吸入麻醉干預(yù)后第三天組TNF-α蛋白表達較干預(yù)后第一天組分別呈減弱趨勢。各組大鼠海馬TNF-α蛋白表達與其基因表達變化一致。
　　結(jié)論：
　　1、糖尿病大鼠經(jīng)1.5MAC異氟烷吸入干預(yù)2小時后早期出現(xiàn)短暫的空間學(xué)習記憶能力下降;而糖尿病大鼠吸入等效劑量七氟烷未出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習記憶能力改變。
　　2、1.5MAC七氟烷或異氟烷吸入干預(yù)2

21、小時對非糖尿病成年大鼠空間學(xué)習記憶能力無明顯影響。
　　3、糖尿病大鼠經(jīng)1.5MAC七氟烷或異氟烷干預(yù)2小時后第一天海馬促炎因子基因和蛋白表達均增加，第三天呈下降趨勢;與異氟烷相比，吸入等效劑量七氟烷大鼠海馬促炎因子表達弱。其與行為學(xué)測試結(jié)果基本一致。
　　4、1.5MAC七氟烷與異氟烷吸入干預(yù)對糖尿病大鼠空間學(xué)習記憶影響及海馬促炎因子表達差異的原因之一可能是二者對Aβ和RAGE的影響，進而激活p38MAPK以及NF-κBp