右美托咪定對(duì)異氟烷引起的幼年大鼠海馬區(qū)神經(jīng)毒性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討右美托咪定預(yù)處理對(duì)7日齡SD幼鼠吸入異氟烷后海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的制備
　　7日齡SD大鼠90只（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），15.2±3.2 g，隨機(jī)分為3組，每組30只，即對(duì)照組(Con group)腹腔注射生理鹽水150μl;異氟烷組（Iso group）腹腔注射生理鹽水150μl;右美托咪定組(Dex group)腹腔注射右美托

2、咪定（50μg/kg）150μl。15分鐘之后對(duì)照組吸入40％的氮氧混合氣體4小時(shí)，異氟烷組和右美托咪定組吸入2％異氟烷與40％氮氧混合氣體4小時(shí)。
　　(1)麻醉結(jié)束后2小時(shí)各組隨機(jī)選取10只鼠用戊巴比妥鈉(100mg/kg)麻醉，4％多聚甲醛心臟灌注斷頭取腦，用TUNEL法（原位末端標(biāo)記法）檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，免疫組化法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞中proBDNF、phospho-JNK、BDNF、phospho-ERK和Caspas

3、e3的蛋白表達(dá)情況。
　　(2)麻醉結(jié)束后2小時(shí)各組隨機(jī)選取8只SD幼鼠斷頭取腦，冰上剝離海馬，應(yīng)用Western-blot法（免疫印跡法）檢測(cè)海馬組織中proBDNF、phospho-JNK/JNK、BDNF、phospho-ERK/ERK和Caspase3的蛋白表達(dá)情況。
　　(3)剩余大鼠分別養(yǎng)至4周齡，各組隨機(jī)選取6只SD幼鼠斷頭取腦，冰上剝離出海馬，用Western-blot法（免疫印跡法）檢測(cè)海馬組織中proBD

4、NF、phospho-JNK/JNK、BDNF、phospho-ERK/ERK和Caspase3的蛋白表達(dá)情況。另外，各組剩余的6只SD大鼠，用4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌注之后斷頭取腦，用TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，免疫組化法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞中proBDNF、phospho-JNK、BDNF、phospho-ERK和Caspase3的蛋白表達(dá)情況。
　　2標(biāo)本的采集處理及檢測(cè)方法
　　2.1 TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋

5、亡率
　　對(duì)照組、異氟烷組及右美托咪定組麻醉結(jié)束2h后各組選取10只腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，固定在動(dòng)物解剖臺(tái)上，剪開(kāi)胸腔，從心尖處插入圓頭針，同時(shí)從右心耳處剪開(kāi)心臟放血，幼鼠在同時(shí)間點(diǎn)先后灌注0.9％生理鹽水5ml沖洗和4％多聚甲醛磷酸緩沖液5ml固定。注射完畢后立即斷頭，把幼鼠大腦從頭顱中取出浸泡在福爾馬林溶液中，用4％的多聚甲醛后固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸臘，包埋，蠟塊行連續(xù)冠狀切片，片厚2.5μm，CA1、CA2

6、、CA3以及齒狀回區(qū)連續(xù)切片備用，用TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。
　　2.2免疫組化法檢測(cè)蛋白的表達(dá)
　　對(duì)照組、異氟烷組及右美托咪定組麻醉結(jié)束2h后各組選取10只腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，固定在動(dòng)物解剖臺(tái)上，剪開(kāi)胸腔，從心尖處插入圓頭針，同時(shí)從右心耳處剪開(kāi)心臟放血，幼鼠在同時(shí)間點(diǎn)先后灌注0.9％生理鹽水5ml沖洗和4％多聚甲醛磷酸緩沖液5ml固定。注射完畢后立即斷頭，把幼鼠大腦從頭顱中取出浸泡在福爾馬林溶液中，用4％

7、的多聚甲醛后固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸臘，包埋，蠟塊行連續(xù)冠狀切片，片厚4μm，CA1，CA2，CA3以及齒狀回區(qū)連續(xù)切片備用。用免疫檢測(cè)法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞中proBDNF、phospho-JNK、BDNF、phospho-ERK和Caspase3的蛋白表達(dá)情況。
　　2.3 Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海馬細(xì)胞蛋白表達(dá)情況
　　對(duì)照組、異氟烷組及右美托咪定組麻醉結(jié)束2h后各組選取8只SD幼鼠斷頭取腦，把大腦

8、放置在冰上分離海馬組織，然后把海馬放在裂解液里放置在冰上超聲勻漿，離心機(jī)上4℃12000r/min離心30min，取上清。Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在發(fā)育中SD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中proBDNF、phospho-JNK/JNK、BDNF、phospho-ERK/ERK和Caspase3的表達(dá)情況。
　　計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x0±s）表示，采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，作圖采用GraphPad Prism5.0軟件。

9、正態(tài)性檢驗(yàn)后做方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差不齊的組間比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　一、7日齡大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化
　　1、異氟烷引起的海馬區(qū)的神經(jīng)損傷
　　實(shí)驗(yàn)中所有的大鼠均為存活狀態(tài)，Tunel染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比(0.0117±0.0043)，異氟烷組(0.0348±0.008

10、6)的大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著增多(P＜0.001，圖1);western blot結(jié)果中，異氟烷組的凋亡標(biāo)記蛋白Caspase3表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.001，圖2）;另外，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)的結(jié)果與western blot結(jié)果一致，異氟烷組的Caspase3明顯比對(duì)照組表達(dá)水平高(P＜0.01，圖3)。
　　2、右美托咪定提供神經(jīng)保護(hù)作用
　　Tunel染色結(jié)果顯示，右美托咪定能夠明顯降低異氟烷引起的新生鼠海馬

11、區(qū)神經(jīng)元的凋亡（P＜0.001，圖1）。Western blot和免疫組化兩種方法檢測(cè)結(jié)果均顯示，與異氟烷組相比，右美托咪定組大鼠海馬內(nèi)Caspase3的表達(dá)顯著減少(P＜0.001，圖2;P＜0.01，圖3)。
　　3、各組中BDNF和proBDNF表達(dá)水平的變化
　　Western blot結(jié)果表明，異氟烷能夠明顯降低BDNF的表達(dá)(P＜0.001，圖2)，而右美托咪定能夠逆轉(zhuǎn)這種變化(P＜0.001，圖2)。另外，與對(duì)

12、照組相比，異氟烷組proBDNF的表達(dá)顯著增多(P＜0.001，圖2)，而右美托咪定組與異氟烷組相比，proBDNF表達(dá)水平明顯降低(P＜0.001，圖2)。與上述結(jié)果一致，免疫組化方法檢測(cè)顯示，右美托咪定能夠逆轉(zhuǎn)異氟烷引起的SD幼鼠海馬區(qū)BDNF和proBDNF的變化(P＜0.01，圖3)。
　　4、phospho-ERK和phospho-JNK的表達(dá)
　　western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，異氟烷組phosp

13、ho-JNK46/JNK46(P＜0.01，圖4)、phospho-JNK54/JNK54（P＜0.01，圖4）表達(dá)增多，phospho-ERK42/ERK42(P＜0.01，圖4)、phospho-ERK44/ERK44（P＜0.01，圖4）表達(dá)減少。而右美托咪定組比異氟烷組phospho-JNK46/JNK46(P＜0.001，圖4)、phospho-JNK54/JNK54(P＜0.001，圖4)表達(dá)減少，phospho-ERK42

14、/ERK42（P＜0.001，圖4）、phospho-ERK44/ERK44（P＜0.001，圖4）表達(dá)增加。
　　二、28日齡大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的變化
　　Tunel結(jié)果、免疫組化結(jié)果以及western blot結(jié)果均顯示，28日齡大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)在各組中均無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能夠降低proBDNF的表達(dá)，可能通過(guò)抑制JNK的激活，減弱異氟烷毒性;
　　2、右美托咪定能