工頻磁場(chǎng)暴露對(duì)大鼠內(nèi)嗅皮層鈣信號(hào)和谷氨酸受體表達(dá)的影響.pdf

1、科學(xué)技術(shù)進(jìn)步日新月異，電子設(shè)備在各行各業(yè)被廣泛應(yīng)用，而隨之產(chǎn)生的電磁輻射逐漸被當(dāng)做一種污染源充斥于人類的生存空間。電磁輻射(Electromagnetic field.EMF)按能量從高到低依次可以分為:微粒輻射、X-射線、紫外線、紅外線輻射、高頻及低頻輻射;按波譜來(lái)分主要可以分為電離類輻射和非電離輻射，包括射頻輻射（Radio frequency.RF）及極低頻電磁場(chǎng)(Extremely low frequency magneticf

2、ields-Electromagnetic field，ELF-EMF)。頻率為50HZ或60HZ的極低頻電磁場(chǎng)又稱為工頻磁場(chǎng)，由電場(chǎng)和磁場(chǎng)組成[1][2][3]。眾所周知，高能量的電離性質(zhì)的輻射及非電離輻射中的射頻輻射對(duì)人體存在較大的損害效應(yīng)。近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到能量相對(duì)較低的極低頻非電離性輻射特別是工頻磁場(chǎng)輻射對(duì)人體健康也同樣存在潛在的威脅。工頻磁場(chǎng)主要由家用電纜，工業(yè)電傳輸設(shè)備等產(chǎn)生。已有研究表明，工頻磁場(chǎng)暴露會(huì)使人類或動(dòng)物的多

3、個(gè)系統(tǒng)發(fā)生病變，例如心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等。亦有文獻(xiàn)報(bào)道工頻磁場(chǎng)暴露與兒童白血病、腦腫瘤、免疫功能下降、過(guò)敏及炎癥反應(yīng)、乳腺癌、流產(chǎn)及心血管異常等多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系[2]。神經(jīng)系統(tǒng)是工頻磁場(chǎng)輻射損傷機(jī)體的一個(gè)重要的靶器官，人們發(fā)現(xiàn)工頻磁場(chǎng)輻射可以影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常活動(dòng)及其介導(dǎo)的不同神經(jīng)功能。已有文獻(xiàn)報(bào)道工頻磁場(chǎng)暴露與阿爾茨海默病、精力下降、學(xué)習(xí)記憶障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展存在著密切聯(lián)系[4][5]

4、。
　　認(rèn)知功能是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個(gè)認(rèn)知腦區(qū)，包括海馬、內(nèi)嗅皮層、前額葉皮層等參與下進(jìn)行的復(fù)雜的心理生理活動(dòng)。這些相關(guān)腦區(qū)中存在多種與不同認(rèn)知行為直接相關(guān)的神經(jīng)元[6]。早在19世紀(jì)人類就發(fā)現(xiàn)由輸電線纜產(chǎn)生的工頻磁場(chǎng)可能損害人的認(rèn)知功能[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種形式的電磁輻射可以通過(guò)不同的機(jī)制影響海馬和前額葉的神經(jīng)活動(dòng)，進(jìn)而影響其介導(dǎo)的認(rèn)知行為損傷。這些發(fā)現(xiàn)提示了我們一個(gè)重要訊息---低能量的工頻磁場(chǎng)可能對(duì)人們的認(rèn)知功能存在損

5、害效應(yīng)[2]，然而目前關(guān)于工頻磁場(chǎng)是通過(guò)何種機(jī)制損害人的認(rèn)知功能報(bào)道甚少。
　　內(nèi)嗅皮層(entorhinal cortex，EC)被認(rèn)為是聯(lián)接海馬及皮層的“橋梁”，內(nèi)嗅皮層中存在空間信息編碼相關(guān)的功能神經(jīng)元，這些神經(jīng)元被認(rèn)為與空間學(xué)習(xí)記憶有著密切的聯(lián)系[7]。為此，本研究以認(rèn)知直接相關(guān)的內(nèi)嗅皮層為主要研究對(duì)象，從細(xì)胞、分子及行為水平，系統(tǒng)性地探索了工頻磁場(chǎng)對(duì)內(nèi)嗅皮層等認(rèn)知腦區(qū)及其介導(dǎo)的認(rèn)知行為的影響，以期對(duì)這一重要問(wèn)題能夠有進(jìn)一

6、步的認(rèn)識(shí)。
　　首先我們觀察比較了工頻磁場(chǎng)輻照暴露組與偽暴露組的離體培養(yǎng)的大鼠內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元的鈣信號(hào)，然后觀察比較了兩組大鼠內(nèi)嗅皮層的谷氨酸受體表達(dá)差異，為同內(nèi)嗅皮層進(jìn)行比較，我們也探測(cè)了其它認(rèn)知腦區(qū)（海馬和前額葉皮層）谷氨酸受體表達(dá)的變化情況;基于谷氨酸受體在突觸可塑性及空間認(rèn)知中的重要作用，最后我們采用T-迷宮實(shí)驗(yàn)，探討了工頻輻照對(duì)大鼠空間工作記憶的影響。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.工頻磁場(chǎng)暴露對(duì)內(nèi)嗅皮層神經(jīng)

7、元鈣信號(hào)的影響
　　原代培養(yǎng)乳大鼠內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元至第12天，將培養(yǎng)細(xì)胞分為暴露組和偽暴露組，在sXcELF系統(tǒng)下進(jìn)入磁場(chǎng)暴露程序。暴露參數(shù)為:頻率50 Hz;強(qiáng)度1或3 mT;時(shí)間24小時(shí);暴露模式為每啟動(dòng)暴露5分鐘后，暫停暴露10分鐘。暴露完成后，立即進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)或細(xì)胞內(nèi)鈣熒光成像檢測(cè)。
　　(1)首先檢測(cè)了工頻磁場(chǎng)輻照對(duì)于培養(yǎng)的內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元全細(xì)胞電流的影響。工頻磁場(chǎng)（強(qiáng)度為1mT或者3 mT）24小時(shí)暴露對(duì)內(nèi)嗅

8、皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元的全細(xì)胞電流（在鉗制電位-70 mV的基礎(chǔ)上，以500 ms，-100至+40 mV的階躍命令電壓誘發(fā)）及電流密度（以膜電容平均化的電流強(qiáng)度）均無(wú)影響。我們同時(shí)也分析了這3組內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元的外向電流成分，包括瞬時(shí)外向電流成分以及持續(xù)性外向電流。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對(duì)照組與輻照組間的瞬時(shí)外向電流成分以及持續(xù)性外向電流成分均無(wú)顯著性差異。
　　(2)工頻磁場(chǎng)（強(qiáng)度為1mT或者3 mT）24小時(shí)暴露并未影響內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神

9、經(jīng)元胞膜上的高閾值激活(HVA)鈣通道電流（在鉗制電位-50 mV的基礎(chǔ)上，以200 ms，-40～+40 mV的階躍命令電壓誘發(fā)）及電流密度。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)證明，對(duì)照組與1 mT和3 mT輻照組間瞬時(shí)及持續(xù)HVA鈣通道電流成分大小均無(wú)顯著性差異，進(jìn)一步分析比較3組間HVA鈣通道瞬時(shí)及持續(xù)電流成分的電流密度，發(fā)現(xiàn)上述3組間仍不存在顯著差異。
　　(3)工頻磁場(chǎng)（強(qiáng)度為1mT或者3 mT）24小時(shí)暴露未影響內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞膜上

10、的低閾值激活(LVA)鈣通道電流（在鉗制電位-120 mV的基礎(chǔ)上，以200 ms，-70～-30 mV的階躍命令電壓誘發(fā)）及電流密度。分離的LVA鈣通道電流主要包括快速失活的瞬時(shí)電流成分。我們對(duì)其電流大?。ǚ逯担┻M(jìn)行計(jì)算并作出相應(yīng)I-V曲線后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、1 mT輻照組和3 mT輻照組的LVA鈣通道電流均呈現(xiàn)出相似的電壓依賴性。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)證明，3組間LVA鈣通道電流大小及相應(yīng)電流密度并不存在顯著性差異。以上結(jié)果提示，工頻磁場(chǎng)輻照對(duì)培

11、養(yǎng)的內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元電壓門(mén)控鈣通道的激活并無(wú)顯著影響。
　　(4)為了進(jìn)一步研究工頻磁場(chǎng)輻照對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元電壓門(mén)控鈣通道失活特性的影響，我們?cè)谇笆鎏禺愋苑蛛x出HVA以及LVA鈣通道電流的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究及分析了其穩(wěn)態(tài)失活特性。通過(guò)分析半失活電位和斜率因子，表明24小時(shí)工頻磁場(chǎng)（強(qiáng)度為1、3 mT）暴露對(duì)內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞膜上的高閾值和低閾值激活鈣通道的失活也無(wú)影響。
　　(5)工頻磁場(chǎng)（強(qiáng)度為1mT或者3 mT

12、）24小時(shí)暴露對(duì)內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞內(nèi)本底鈣離子濃度沒(méi)有影響，但影響了高鉀(10 mM)刺激在這些神經(jīng)元胞內(nèi)誘發(fā)的鈣動(dòng)態(tài)變化，表現(xiàn)為劑量依賴地降低了高鉀引起的胞內(nèi)鈣濃度增加的最大值。
　　(6)使用Thapsigargin（TG，Ca2+-ATP酶抑制劑，5μM）清空內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣庫(kù)后，完全阻斷了工頻磁場(chǎng)（強(qiáng)度為1mT或者3mT）24小時(shí)暴露對(duì)高鉀(10mM)刺激誘發(fā)的神經(jīng)元胞內(nèi)鈣動(dòng)態(tài)變化的影響。
　　2.

13、工頻磁場(chǎng)暴露對(duì)大鼠內(nèi)嗅皮層谷氨酸受體表達(dá)的影響
　　離子型谷氨酸受體在內(nèi)嗅皮層參與了興奮性突觸傳遞及可塑性，與學(xué)習(xí)記憶功能有密切關(guān)系。為此，我們進(jìn)一步檢測(cè)了工頻輻照對(duì)內(nèi)嗅皮層的AMPA和NMDA受體亞基（AMPA受體:GluA1，GluA2，GluA3; NMDA受體:GluN1，GluN2A，GluN2B）的表達(dá)的影響。
　　(1)工頻磁場(chǎng)暴露14天（4小時(shí)/天，0.5mT）并未影響大鼠內(nèi)嗅皮層構(gòu)成AMPA受體主要亞基，即

14、GluA1，GluA2和GluA3表達(dá)水平。為了進(jìn)行比較，我們也同時(shí)檢測(cè)了海馬和在前額葉皮層認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)的AMPA受體亞基的表達(dá)。同內(nèi)嗅皮層相同，14天工頻輻照也未影響海馬的AMPA受體亞基的表達(dá)。而在前額葉，GluA3的表達(dá)水平顯著地降低(n=5，P＜0.05)，與內(nèi)嗅皮層一樣，其余兩種亞基表達(dá)均未受到影響。
　　(2)工頻磁場(chǎng)暴露14天后，使得大鼠內(nèi)嗅皮層NMDA受體亞基GluN1和GluN2A蛋白的量有所增加(n=5，P＜0

15、.05)，但GluN2B蛋白的量未發(fā)現(xiàn)明顯變化。同內(nèi)嗅皮層相比，工頻輻照引起了前額葉皮層NMDA受體亞基相同的表達(dá)變化。在海馬，輻照同樣也增加了GluN2A蛋白量(n=5，P＜0.05)，引起了GluN2B表達(dá)上調(diào)(n=5，P＜0.05)，但GluN1未受影響。
　　(3)我們將相同的輻照暴露模式時(shí)間延長(zhǎng)到28天，再次檢測(cè)內(nèi)嗅皮層中各種亞型的蛋白表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)嗅皮層AMPA受體的GluA2表達(dá)量減少(n=6，P＜0.05)，

16、其它亞基的表達(dá)量均未發(fā)生明顯變化(n=6，P＞0.05)。同內(nèi)嗅皮層相比，28天工頻磁場(chǎng)暴露均未影響海馬和前額葉的AMPA受體亞基的表達(dá)量。這些數(shù)據(jù)表明AMPA受體GluA2亞基在內(nèi)嗅皮層較海馬和前額葉對(duì)工頻輻照更為敏感。
　　(4)對(duì)于NMDA受體亞基，28天工頻磁場(chǎng)暴露之后，內(nèi)嗅皮層GluN2A表達(dá)量減少(n=6，P＜0.05)，而GluN2B的表達(dá)量有所增加(n=6，P＜0.05)，GluN1卻未發(fā)現(xiàn)明顯變化。與內(nèi)嗅皮層相同

17、，在海馬區(qū)，工頻磁場(chǎng)暴露28天后GluN2B表達(dá)也發(fā)生上調(diào)(n=6，P＜0.05)，并且GluN1未發(fā)現(xiàn)明顯變化。然而海馬的GluN2A較內(nèi)嗅皮層的敏感性低，在輻照暴露28天后未發(fā)生明顯改變。非常有意思的是，相對(duì)于內(nèi)嗅皮層，前額葉皮層GluN2A和GluN2B對(duì)28天工頻磁場(chǎng)暴露并不敏感，而其GluN1的表達(dá)卻在輻照暴露后上調(diào)。
　　(5)與此相同條件下，我們最后探討了工頻磁場(chǎng)輻射暴露對(duì)大鼠空間工作記憶的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著訓(xùn)練天

18、數(shù)的增加，大鼠在T-迷宮中的選擇正確率逐漸增加。然而，14天或28天的工頻磁場(chǎng)輻射連續(xù)暴露并沒(méi)有顯著影響大鼠的空間工作記憶，表明工頻輻照引起內(nèi)嗅皮層分子水平的變化不足以影響大鼠的空間工作記憶。
　　綜上，內(nèi)嗅皮層是工頻磁場(chǎng)輻照的易損腦區(qū)，工頻磁場(chǎng)輻照劑量依賴地降低了高K+引起的胞內(nèi)鈣濃度增加。與此同時(shí)，暴露于工頻磁場(chǎng)輻照環(huán)境中，大鼠的內(nèi)嗅皮層的AMPA和NMDA受體構(gòu)成發(fā)生顯著改變，但這些分子水平的改變并未顯著影響到大鼠的空間工作