鐵在谷氨酸興奮性毒性中的重要作用及運(yùn)動神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的一種慢性神經(jīng)退行性疾病，以腦和脊髓中選擇性的運(yùn)動神經(jīng)元變性為特征，臨床表現(xiàn)為緩慢起病，進(jìn)行性發(fā)展。ALS是一種致死性疾病，患者多在首次出現(xiàn)癥狀后的3～5年內(nèi)死亡。目前，該病病因不清、發(fā)病機(jī)制不明、缺乏有效的治療方法。目前證據(jù)提示ALS運(yùn)動神經(jīng)元的丟失是由于一些復(fù)雜的相互作用的機(jī)制所致，包括氧化應(yīng)激、興奮性毒性作用、細(xì)胞骨架異常和蛋白聚集以及遺傳因素等。諸多研究表明這些機(jī)制之間并不是相互排斥的，

2、在最終導(dǎo)致ALS的運(yùn)動神經(jīng)元死亡的不同機(jī)制中氧化應(yīng)激可能起中心作用。
　　 氧化應(yīng)激是指活性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生過多引起的細(xì)胞損傷。神經(jīng)系統(tǒng)氧耗量大，多不飽和脂肪酸含量豐富，抗氧化能力相對較弱。與其他器官相比，神經(jīng)系統(tǒng)更易受到氧化損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)含有非血紅素鐵，并且在特定部位如黑質(zhì)和基底節(jié)中鐵含量非常豐富。諸多研究表明，鐵與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。鐵離子如果不能以適當(dāng)方式與蛋白或其它配體結(jié)合，其可以通過

3、Fenton反應(yīng)催化形成具有代謝毒性的ROS，攻擊生物大分子，從而引起神經(jīng)元變性。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，在多種神經(jīng)退行性疾病中都存在氧化應(yīng)激和異常鐵積聚的現(xiàn)象，如包括帕金森病和阿爾茨海默病在內(nèi)多種神經(jīng)退行性疾病病人腦內(nèi)呈現(xiàn)病理性、區(qū)域性鐵沉積。據(jù)此推測，鐵過載導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在ALS的發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。
　　 應(yīng)用谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑蘇-羥天冬氨酸（THA）誘導(dǎo)的脊髓體外器官型培養(yǎng)谷氨酸興奮性毒性模型，探討鐵在谷氨酸興奮性毒性中的

4、作用，以及綠茶多酚EGCG和萊菔硫烷（SF）對運(yùn)動神經(jīng)元的作用和機(jī)制。采用免疫組織化學(xué)方法觀察運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目和形態(tài)，用Western blot方法檢測標(biāo)本蛋白水平的變化，用多功能酶標(biāo)儀檢測乳酸脫氫酶、丙二醛和谷氨酸的變化。研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸興奮性毒性模型中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)升高，鐵蛋白表達(dá)降低，組織內(nèi)總鐵含量增加，氧化應(yīng)激水平升高，運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目減少，給予鐵螯合劑去鐵敏可以有效阻止THA導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，保護(hù)運(yùn)動

5、神經(jīng)元。綠茶多酚EGCG作用機(jī)制復(fù)雜，我們研究表明，EGCG可以通過降低細(xì)胞間隙的谷氨酸來對抗THA引起的興奮性毒性，減輕氧化應(yīng)激，保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元。萊菔硫烷是一個(gè)非常有效的Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑，在腫瘤研究中，諸多學(xué)者對其進(jìn)行了深入地探討。發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷可以通過誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶有效對抗THA引起的運(yùn)動神經(jīng)元死亡。另外，對谷氨酸興奮性毒性模型進(jìn)行了深入地分析研究，為進(jìn)一步應(yīng)用此模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究夯實(shí)了基礎(chǔ)。通過上述一系列實(shí)驗(yàn)研究，闡明了鐵在谷氨酸興奮性毒

6、性中的重要作用以及EGCG和萊菔硫烷通過不同的機(jī)制保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元。這對于研究肌萎縮側(cè)索硬化的發(fā)病機(jī)制和篩選有效的治療藥物提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。
　　 第一部分鐵在谷氨酸興奮性毒性中的重要作用
　　 目的：在脊髓體外器官型培養(yǎng)谷氨酸興奮性毒性模型中，觀察鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存蛋白和鐵含量的變化，并且應(yīng)用鐵螯合劑去鐵敏，觀察其對運(yùn)動神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用。
　　 方法：應(yīng)用脊髓體外器官型培養(yǎng)模型，隨即分成3組：對照組、THA組

7、和DFO+THA組。應(yīng)用Western blot方法檢測鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存蛋白水平的變化，用原子吸收光譜法測量組織中鐵含量的變化，用免疫組化方法檢測運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目，用多功能酶標(biāo)儀檢測組織中丙二醛的變化以及培養(yǎng)液中谷氨酸和乳酸脫氫酶的變化。
　　 結(jié)果：100μmol/L THA處理3周后，TfR、DMT1-IRE和DMT1+IRE蛋白表達(dá)升高，而Ft-H蛋白表達(dá)下降，組織中總鐵含量增加。給予鐵螯合劑DFO可以有效阻止THA引起的興奮性

8、毒性，保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元。但是DFO對于培養(yǎng)液中的谷氨酸沒有影響。
　　 結(jié)論：鐵在谷氨酸興奮性毒性中起到重要作用，螯合鐵可以有效阻止谷氨酸興奮性毒性引起的運(yùn)動神經(jīng)元損傷。
　　 第二部分綠茶多酚EGCG對運(yùn)動神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制探討
　　 目的：探討綠茶多酚EGCG對運(yùn)動神經(jīng)元的作用和機(jī)制，為尋找肌萎縮側(cè)索硬化的治療藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法：應(yīng)用脊髓體外器官型培養(yǎng)模型，隨機(jī)分成3組：對照組、THA組和EG

9、CG+THA組。用免疫組化方法檢測運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目，用Westernblot方法檢測Ⅱ相酶蛋白水平的變化，用多功能酶標(biāo)儀檢測組織中丙二醛的變化以及培養(yǎng)液中谷氨酸和乳酸脫氫酶的變化。
　　 結(jié)果：100μmol/L， THA干預(yù)后運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目較正常對照組明顯減少，而用5μmol/L EGCG預(yù)處理48小時(shí)，再給予5μmol/LEGCG+100μmol/L THA聯(lián)合處理3周后運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目較THA組明顯增加。EGCG+THA組培養(yǎng)

10、液中谷氨酸的含量較THA組明顯降低，同時(shí)檢測MDA水平也顯著下降。與Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑SF保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元不同，EGCG+THA處理3周后Ⅱ相解毒酶NQO-1和HO-1表達(dá)較THA組下降。
　　 結(jié)論：EGCG通過降低細(xì)胞間隙的谷氨酸，可以阻止THA引起的興奮性神經(jīng)毒性，保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元。
　　 第三部分萊菔硫烷誘導(dǎo)Ⅱ相酶表達(dá)保護(hù)大鼠脊髓運(yùn)動神經(jīng)元
　　 目的：探討Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑萊菔硫烷（SF）對運(yùn)動神經(jīng)元的作用和機(jī)制。

11、r>　　 方法：應(yīng)用SD乳鼠脊髓體外器官型培養(yǎng)模型，隨機(jī)分成3組：對照組、THA組和SF+THA組。用免疫組化法檢測運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目，用Western blot法檢測Ⅱ相酶蛋白水平，用多功能酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)液中谷氨酸的變化。
　　 結(jié)果：THA干預(yù)后運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目較對照組明顯減少，而應(yīng)用SF預(yù)處理48 h，再給予SF和THA聯(lián)合處理3周后運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目較THA組明顯增加，同時(shí)Ⅱ相酶NQO-1和HO-1表達(dá)明顯升高。
　　

12、結(jié)論：SF通過誘導(dǎo)Ⅱ相酶NQO-1和HO-1的表達(dá)，可以有效預(yù)防THA引起的運(yùn)動神經(jīng)元損傷。
　　 第四部分谷氨酸興奮性毒性模型的研究
　　 目的：探討谷氨酸興奮性毒性模型-THA誘導(dǎo)的脊髓器官型培養(yǎng)模型培養(yǎng)液各成分中谷氨酸的含量及模型培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中谷氨酸的變化。
　　 方法：應(yīng)用脊髓體外器官型培養(yǎng)模型，隨機(jī)分成2組：對照組、THA組。用免疫組化法檢測運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目，用多功能酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)基中谷氨酸的含量。