人食管下括約肌興奮性和抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特征.pdf

1、目的：食管下括約肌(Lower esophageal sphineter，LES)主要受腸肌神經(jīng)元支配，本研究探討了支配人食管下括約肌鉤狀纖維(clasp舶res)和套索纖維(sling fibres)必奮性和抑制性腸肌運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的形態(tài)和分布特征。 方法： 1 標(biāo)本制備：選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2006．年3月到11月因高位食管中段癌行食管大部切除術(shù)崽者20例，其中男10例，女10例，平均年齡53歲。將采集新鮮食管胃結(jié)

2、合部(Esophagogastric junction，GEJ)手術(shù)標(biāo)本，以下列兩種方式切開，一種沿大彎側(cè)切開以保留完整鉤狀纖維，另一種沿小彎側(cè)切開以保留完整套索纖維。將標(biāo)本粘膜面向上固定到附有Sylgard184膠培養(yǎng)皿中，用無菌Krebs液反復(fù)沖洗，并持續(xù)通以5％CO<,2>和95％O<,2>混合氣體。將整個(gè)標(biāo)本粘膜層及部分粘膜下層解剖掉，并在解剖顯微鏡下把鉤狀纖維或套索纖維上的粘膜下層全部仔細(xì)去掉。 2 熒光標(biāo)記：將1個(gè)

3、覆有熒光染料羰花青DiI(1,1-didodecyl 3，3，3’，3’-indocarbocyanine perchlorate，DiI)直徑200μm玻璃珠放在鉤狀纖維或套索纖維上，輕壓10分鐘后，使玻璃珠粘附在肌纖維上，添加培養(yǎng)基DEM/F12250ml到盛有標(biāo)本的培養(yǎng)皿中，然后在37℃孵育箱孵育5天，每日更換一次培養(yǎng)液，使熒光性物質(zhì)DiI被支配食管下括約肌肌纖維的腸肌運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突末梢攝取，并逆行性轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)元胞體。5天后，把培

4、養(yǎng)后的標(biāo)本放入4℃調(diào)整Zamboni’s液，固定16-24小時(shí)，再用PBS液反復(fù)沖洗。 3 免疫組化：用顯微鑷將肌問神經(jīng)叢上的環(huán)行肌全部撕去，制成肌間叢貼附在縱行肌上的整裝標(biāo)本。放入90％甘油碳酸氫鹽緩沖液浸洗3天。將含lO％的正常羊血清鼠抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Ch01ine acetyltransferase，ChAT)或兔抗一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)稀釋-抗滴加到整裝標(biāo)本上，在室溫下于濕

5、盒中孵育4天。用PBS液反復(fù)沖洗后，將FITC標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔血清加入標(biāo)本中，于室溫下在濕盒中孵育2天。再用PBS液反復(fù)沖洗后，將標(biāo)本裝入90％甘油碳酸氫鹽緩沖液中，在落射熒光顯微鏡下觀察記錄被標(biāo)記神經(jīng)元胞體位置及免疫活性，拍攝標(biāo)記清晰的神經(jīng)元，并分析其形態(tài)。免疫疫附性和免疫陰性神經(jīng)元所占比例用mean±SEM表示，其支配優(yōu)勢的顯著性差異采用Wilcoxon Signed Ranks Test(SPSS 12.0)。P<0.05為有

6、顯著差異。 結(jié)果： 1 在DiI標(biāo)記點(diǎn)上，可以看到一束被強(qiáng)標(biāo)記的平滑肌細(xì)胞，在其正下方，有直徑約1 mm熒光斑。 2 當(dāng)標(biāo)本沿大彎側(cè)剪開時(shí)，鉤狀纖維得以完整保存，可以看到位于食管下段的半環(huán)形肌束。當(dāng)附載DiI的玻璃珠標(biāo)記在該肌纖維上時(shí)，支配該肌的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元被標(biāo)記。在10例標(biāo)本中，總共觀察到292個(gè)神經(jīng)元(每例標(biāo)本觀察到15-45個(gè)標(biāo)記神經(jīng)元；平均29±3)。其中52％ (SEM=5％)位于標(biāo)記點(diǎn)的口

7、側(cè)，即為降行性神經(jīng)元。45％(SEM=6％)位于標(biāo)記點(diǎn)2mm范圍內(nèi)，即為局部伸經(jīng)元，只有約3％位于肛側(cè)。在用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記的5例標(biāo)本中，平均31％(SEM=1％；)具有ChAT活性，35％(SEM=2％)的局部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有ChAT活性，而口側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元只有25％(SEM=7％)具有ChAT活性。在用NOS標(biāo)記的5例標(biāo)本中，DiI標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中65％(SEM=2％)有NOS免疫活性(Wilcoxon Signed RanksTe

8、st；P=0.039)，其中.口側(cè)85％(SEM=4％)有NOS免疫活性。 3 當(dāng)標(biāo)本沿食管胃結(jié)合部小彎側(cè)剪開時(shí)，sling纖維得以完整保存，可以看到起于食管末端增厚的不完整U形肌束。當(dāng)附載Dil的玻璃珠標(biāo)記在該肌纖維上時(shí)，可以觀察到支配該肌的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分布。在10例標(biāo)本中，觀察到433(每例標(biāo)本觀察到21-73個(gè)標(biāo)記神經(jīng)元；平均43土6)個(gè)神經(jīng)元。在這些細(xì)胞中，46％(SEM=2％)位于肛側(cè)，43％(SEM=6％)位于局部。

9、在用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記的5例標(biāo)本中，平均58％(SEM=2％)具有ChAT活性(Wilcoxon Signed Ranks Test；P=0.042)，62％(SEM=2％)的局部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及66％(SEM=3％)肛側(cè)神經(jīng)元具有ChAT活性。在用NOS標(biāo)記的5例標(biāo)本中，DiI標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中36％(SEM=2％)有NOS免疫活性。其中口側(cè)64％(SEM=10％)有NOS免疫活性。 4 在標(biāo)記的神經(jīng)元中，DiI可以顯示神經(jīng)元胞

10、體，而神經(jīng)核很少被DiI染色。在一些被充分標(biāo)記的神經(jīng)元中，樹突和軸突也可以看到。所有被充分標(biāo)記的細(xì)胞柏有單一軸突和許多細(xì)絲狀樹突，符合DogielI型細(xì)胞特征。 結(jié)論： 1 DiI標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)遠(yuǎn)主要有膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶或一氧化氮合酶活性，分別被認(rèn)為是興奮運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。． 2 支配鉤狀纖維的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元主要位于局部和口腔側(cè)，抑制性神經(jīng)元占多數(shù)，大部分降行性神經(jīng)原為抑制性的，局部約有一半運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有N