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文檔簡介
1、TDP43由人類TARDBP基因編碼產(chǎn)生。人類TARDBP基因位于1號(hào)染色體短臂3區(qū)6帶上,并且編碼414個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),分子量大約43kDa即TDP43。近幾年,在部分額顳葉癡呆(FTLD-U)和肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)患者的病理研究中發(fā)現(xiàn)泛素陽性的包涵體,而TDP43是這種包涵體的主要組成部分。TDP43主要位于細(xì)胞核中,并且在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中穿梭。參與到RNA運(yùn)輸、翻譯、維持穩(wěn)定性、降解等多個(gè)環(huán)節(jié)。但是在部分ALS和FT
2、LD-U患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,TDP43由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集,并且被泛素化、磷酸化且部分是以剪切的片段形式存在。TDP43基因很有可能是繼SOD1基因后發(fā)現(xiàn)的引起ALS的又一高突變基因。攜帶SOD1突變基因的小鼠在出現(xiàn)臨床癥狀前就已經(jīng)表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的高興奮性。神經(jīng)元的高興奮性可能促進(jìn)能量代謝,增加ATP消耗,加重線粒體負(fù)擔(dān),最終導(dǎo)致能量耗竭,推進(jìn)臨床癥狀的發(fā)展。然而表達(dá)突變和野生型TDP43蛋白的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞的興奮性水平還
3、不清楚。目前對(duì)TDP43基因與ALS之間關(guān)系的研究越來越多,有研究顯示在NSC34細(xì)胞中,野生型和突變的TDP43基因可以導(dǎo)致線粒體形態(tài)異常,線粒體復(fù)合物1的下調(diào)和線粒體膜電位丟失和線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)表達(dá)水平的升高,同時(shí)有研究表明雙甲氧姜黃素可以下調(diào)UCP2的表達(dá)提高線粒體跨膜電勢(shì),改善線粒體復(fù)合物1的活動(dòng)和線粒體的形態(tài),進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元。此外,我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究顯示,姜黃素的類似物雙甲氧姜黃素(DimethoxyCur
4、cumin,DMC),可以改善自噬體和溶酶體的融合障礙,增強(qiáng)自噬性清除毒性蛋白的能力。但是給予DMC后,表達(dá)突變和野生型TDP43蛋白的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞的興奮性水平是否有改變,我們?nèi)匀徊磺宄?br> 目的:研究穩(wěn)定表達(dá)突變TDP43蛋白(Q331和野生型TDP43蛋白的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞動(dòng)作電位的特性,推測(cè)興奮性水平;以及給予雙甲氧姜黃素后,細(xì)胞動(dòng)作電位的特性是否改變,分析TDP43蛋白在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用。
方
5、法:本實(shí)驗(yàn)選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Emptyvector、TDP43Widetype、TDP43Q331K三個(gè)NSC34細(xì)胞系。這三種細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,采用脂質(zhì)體將三種不同的TDP43基因轉(zhuǎn)入NSC34細(xì)胞。參考NSC34細(xì)胞系的方法進(jìn)行培養(yǎng),采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行鑒定TDP43表達(dá)。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),通過記錄這三種細(xì)胞的動(dòng)作電位,研究這三種細(xì)胞在潛伏期,閾電位,幅度及動(dòng)作電位頻率方面的情況,并觀察這些指標(biāo)在給予雙甲氧姜黃素后的變化。
6、r> 結(jié)果:
1給藥前Empty組、WT組、Q331K組這三組細(xì)胞組間動(dòng)作電位特性比較
與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的NSC34細(xì)胞(Empty組)相比,轉(zhuǎn)染野生型TDP43基因的NSC34細(xì)胞(WT組)在動(dòng)作電位潛伏期上明顯縮短,在給予所有去極化電流時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。20pA時(shí)Empty組205.69±42.35msWT組152.87±24.28ms;30pA時(shí)Empty組164.54±43.55ms
7、WT組130.64±12.12ms;40pA時(shí)Empty組138.21±28.86msWT組112.25±9.25ms;60pA時(shí)Empty組111.54±19.83msWT組92.85±9.13ms;80pA時(shí)Empty組98.64±13.94msWT組80.79±6.40ms,其余指標(biāo)和Empty組沒有區(qū)別(P>0.05)。
與Empty組相比,轉(zhuǎn)染突變型TDP43基因(Q331K組)的細(xì)胞在動(dòng)作電位頻率明顯增快,在給
8、予30、40、60、80pA去極化電流時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。30pA時(shí)Q331K組13.35±2.04HzEmpty組11.15±1.90Hz;40pA時(shí)Q331K組15.24±1.77HzEmpty組11.93±2.36Hz;60pA時(shí)Q331K組17.44±1.65HzEmpty組13.63±2.60Hz;80pA時(shí)Q331K組18.37±1.75HzEmpty組14.33±1.73Hz。其余指標(biāo)和Empty組沒有區(qū)別(P
9、>0.05)。
與WT組相比,Q331K組細(xì)胞的動(dòng)作電位頻率明顯升高,在30、60、80pA時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。30pA時(shí)Q331K組13.35±2.04HzWT組11.57±2.44Hz;60pA時(shí)Q331K組17.44±1.65HzWT組13.62±2.53Hz;80pA時(shí)Q331K組18.37±1.75HzWT組14.68±2.24Hz。其余指標(biāo)和WT組沒有區(qū)別(P>0.05)。
2Empt
10、y、WT、Q331K這三組細(xì)胞在給藥前后動(dòng)作電位特性比較
Empty組在給藥后動(dòng)作電位幅度顯著降低,在給予20、30、40、60和80pA時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。20pA時(shí)給藥前63.86±9.92mv給藥后52.57±10.78mv;30pA時(shí)給藥前69.29±9.47mv給藥后55.43±11.14mv;40pA時(shí)給藥前72.60±7.06mv給藥后59.47±10.00mv;60pA時(shí)給藥前77.28±6.
11、27mv給藥后63.51±10.80mv;80pA時(shí)給藥前81.14±4.77mv給藥后66.75±10.86mv。其余指標(biāo)在給藥前后沒有區(qū)別(P>0.05)。
WT組在給藥后動(dòng)作電位幅度顯著降低,在給予20、30pA去極化電流時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),20pA時(shí)給藥前67.35±14.66mv給藥后53.46±10.08mv;30pA時(shí)給藥前70.83±13.91mv給藥后56.59±10.16mv;其余指標(biāo)在給藥
12、前后沒有區(qū)別(P>0.05)。
Q331K組細(xì)胞在給藥后動(dòng)作電位幅度明顯降低在給予20、30、40、60和80pA時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。20pA時(shí)給藥前63.40±10.34mv給藥后51.60±7.67mv;30pA時(shí)給藥前65.73±9.40mv給藥后55.27±7.85mv;40pA時(shí)給藥前72.04±8.58mv給藥后55.95±8.40mv;60pA時(shí)給藥前75.50±9.83mv給藥后59.16±5
13、.51mv;80pA時(shí)給藥前76.54±7.79mv給藥后61.76±6.14mv。
Q331K組在給藥后動(dòng)作電位頻率顯著減慢在40、60、80pA時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),40pA時(shí)給藥前15.24±1.77Hz給藥后12.08±2.25Hz;60pA時(shí)給藥前17.44±1.65Hz給藥后12.34±2.37Hz;80pA時(shí)給藥前18.37±1.75Hz給藥后13.36±3.02Hz。
Q331K組在
14、給藥后閾電位明顯提高,在給予20、30、40、60和80pA時(shí)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。20pA時(shí)給藥前-28.05±5.00mv給藥后-19.48±5.49mv;30pA時(shí)給藥前-28.05±5.00mv給藥后-19.48±5.49mv;40pA時(shí)給藥前-30.13±4.28mv給藥后-19.48±5.49mv;60pA時(shí)給藥前-30.13±4.28mv給藥后-20.34±5.67mv;80pA時(shí)給藥前-30.13±4.28mv
15、給藥后-20.03±6.49mv,其余指標(biāo)在給藥前后沒有區(qū)別(P>0.05)。
3再給予DMC后,Empty組、WT組、Q331K組這三組細(xì)胞組間動(dòng)作電位特性比較,在動(dòng)作電位潛伏期、閾電位、幅度及動(dòng)作電位頻率沒有區(qū)別(P>0.05)。
結(jié)論:給予雙甲氧姜黃素前,WT組和Q331K組細(xì)胞的興奮性明顯高于Empty組細(xì)胞。野生型TDP43和突變型TDP43(Q331K)均有可能參與到ALS的發(fā)病過程中。突變型TD
16、P43(Q331K)細(xì)胞的興奮性更高,對(duì)神經(jīng)損害可能更嚴(yán)重。
給予雙甲氧姜黃素后,Q331K組細(xì)胞的閾電位顯著提高,動(dòng)作電位頻率明顯減慢,興奮性明顯降低,雙甲氧姜黃素可能參與到TDP43基因相關(guān)的神經(jīng)損害的保護(hù)中。給予雙甲氧姜黃素后,這三組細(xì)胞的動(dòng)作電位幅度均明顯降低,提示雙甲氧姜黃素對(duì)轉(zhuǎn)染野生型和突變型TDP43基因和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞的鈉通道可能會(huì)產(chǎn)生影響。
給予雙甲氧姜黃素后,Empty組、WT組和Q331
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