二氮嗪對新生大鼠缺氧缺血腦損傷后細胞骨架蛋白穩(wěn)定作用研究.pdf

1、目的：
　　采用宮內(nèi)窒息誘發(fā)新生鼠缺氧缺血腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)模型,探討線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive K+channels,mitoKATP)開放劑二氮嗪是否可通過穩(wěn)定纖維形肌動蛋白(fibrous actin,F-actin)發(fā)揮對新生大鼠HIBD后的保護作用,為臨床上開發(fā)mitoKATP通道開放劑治療新生兒缺氧缺血性腦

2、病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)提供實驗依據(jù)。
　　材料與方法：
　　取孕21天Sprague Dawley(SD)大鼠麻醉后剖腹,結(jié)扎其子宮動靜脈建立宮內(nèi)窒息誘發(fā)新生大鼠HIBD模型,剖宮產(chǎn)取出的新生大鼠分為假手術(shù)組、窒息組、二氮嗪組、二氮嗪+格列苯脲組及溶劑組,其中假手術(shù)組僅行剖宮產(chǎn)術(shù)而不予結(jié)扎子宮動靜脈。取出新生大鼠后0h、12h、24h分別腹腔注射相應(yīng)藥物。采用光學(xué)顯微鏡和

3、電鏡觀察神經(jīng)細胞組織學(xué)改變,2,3,5-氧化三苯基甲氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride monohydrate,TTC)染色試驗方法及蛋白質(zhì)印跡(western blot)方法分別觀察HIBD后腦缺血情況及腦皮質(zhì)F-actin蛋白表達情況。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用SPSS for Windows 17.0統(tǒng)計軟件進行資料分析,采用單因素方差分析比較組間差異,各組間兩兩比較以最

4、小顯著差值法分析,P<0.05表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.HE染色觀察腦細胞損傷病理改變
　　假手術(shù)組腦細胞結(jié)構(gòu)完整、排列有序,細胞周圍間隙正常,細胞核清晰可見,胞漿染色均勻。窒息組細胞密度明顯減低,排列紊亂,可見大量細胞水腫,神經(jīng)元數(shù)目減少,部分區(qū)域可見大片細胞核固縮等壞死性改變及神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生。二氮嗪組細胞排列較整齊,組織結(jié)構(gòu)基本完整,大部分細胞核清晰可見,神經(jīng)細胞的壞死及變性程度較窒息組明顯減輕

5、,可見部分神經(jīng)細胞水腫。二氮嗪+格列苯脲組細胞密度減低,細胞周圍間隙增寬,部分區(qū)域可見局灶性壞死。溶劑組細胞排列較紊亂,細胞密度減低,細胞核出現(xiàn)固縮、溶解表現(xiàn),胞漿染色不均。
　　2.TTC染色觀察腦缺血程度改變
　　宮內(nèi)窒息剖宮產(chǎn)后24h新生大鼠出現(xiàn)明顯腦缺血,腦片平均光密度明顯降低(156.3±13.6),與假手術(shù)組相比(222.1±21.1)差異有顯著性(P<0.01)。二氮嗪明顯減輕腦缺血程度,腦片平均光密度顯著升高

6、(204.6±14.9),與窒息組相比差異有顯著意義(P<0.01)。格列苯脲抵消了二氮嗪的腦保護作用,明顯降低了腦片的平均光密度(166.8±17.2),與二氮嗪組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.電鏡觀察神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)改變
　　假手術(shù)組細胞內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體均很清楚,線粒體數(shù)量多,結(jié)構(gòu)清楚,嵴排列規(guī)整。窒息組線粒體數(shù)目明顯減少,線粒體結(jié)構(gòu)模糊不清,嵴紊亂、縮小和部分消失,線粒體出現(xiàn)空泡樣改變,

7、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒,高爾基復(fù)合體裂解。二氮嗪組神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)基本正常,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體尚清楚,較多線粒體結(jié)構(gòu)相對完整,部分線粒體稍腫脹,基質(zhì)減少,嵴排列稍不規(guī)整。
　　4.western blot結(jié)果
　　窒息組皮質(zhì)F-actin蛋白量明顯低于假手術(shù)組(P<0.01);二氮嗪干預(yù)后皮質(zhì)細胞骨架崩解減少,F-actin蛋白量增加,與HI組相比有顯著差異(P<0.01);格列苯脲可逆轉(zhuǎn)二氮嗪對細胞骨架的穩(wěn)定保護作用,細胞骨架崩解

8、增加,F-actin蛋白量與二氮嗪組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.宮內(nèi)窒息后新生大鼠出現(xiàn)明顯的缺氧缺血腦損傷,表現(xiàn)在:細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的病理改變?nèi)缂毎[、變性及壞死;腦缺血程度嚴重;細胞超微結(jié)構(gòu)如線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)破壞或消失;細胞骨架F-actin蛋白降解。
　　2.窒息新生大鼠經(jīng)mitoKATP通道開放劑二氮嗪干預(yù)后,細胞變性、壞死程度減輕,腦缺血程度得到明顯減輕,線粒體形態(tài)改